不同立木級(jí)木荷對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)研究

柳翼飛，王小德，黃 可，曹俊卓，張晶月

(浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 臨安 311300)

木荷 (Schima superba)，為亞熱帶樹(shù)種，具有許多優(yōu)良性狀，集用材、抗災(zāi)和觀賞于一體，是近年來(lái)大力發(fā)展的珍貴鄉(xiāng)土樹(shù)種，在植被恢復(fù)及林業(yè)生產(chǎn)上得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。低溫傷害使細(xì)胞膜受損，細(xì)胞膜相對(duì)透性變大［1］，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外泄。因此，電解質(zhì)外滲率的變化能反映組織受傷害程度和植物的抗寒性大小，實(shí)驗(yàn)中通常用逆境傷害前后質(zhì)膜的相對(duì)電導(dǎo)率來(lái)直觀的表示膜內(nèi)電解質(zhì)外滲率［2］。低溫下，植物體可通過(guò)保護(hù)性酶如超氧化物歧化酶 (SOD)、過(guò)氧化物酶 (POD)等，清除活性氧自由基［3］、積累大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì) (可溶性蛋白、可溶性糖等)［4］調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓等方式減輕低溫對(duì)植物的傷害。很多實(shí)驗(yàn)證實(shí)［5-8］，SOD-POD的活性水平可以間接反映植物抗寒能力的高低，而可溶性蛋白、可溶性糖含量的增加有利于植物抗寒性的提高。

本研究以5種立木級(jí)木荷為試驗(yàn)材料，通過(guò)抗寒性生理指標(biāo)的測(cè)定對(duì)木荷的抗寒機(jī)制進(jìn)行初步探討，為木荷的南樹(shù)北擴(kuò)以及栽培養(yǎng)護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)的木荷選自浙江農(nóng)林大學(xué)植物園。參照立木級(jí)的劃分標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)立木級(jí)選擇平均標(biāo)準(zhǔn)左右、具有代表性的木荷植株，生長(zhǎng)狀況基本相同。Ⅰ級(jí):劃分標(biāo)準(zhǔn)h＜0.33 m，試材規(guī)格0.2 m ＜h＜0.3 m。Ⅱ級(jí):劃分標(biāo)準(zhǔn) d＜2.5 cm;h＞0.33 m，試材規(guī)格1 cm ＜d＜2 cm;1.5 m＜h＜2.5 m。Ⅲ級(jí):劃分標(biāo)準(zhǔn)d=2.5～7.5 cm，試材規(guī)格d=4～7 cm。Ⅳ級(jí):劃分標(biāo)準(zhǔn)d=7.5～22.5 cm，試材規(guī)格d =25～ ＜30 cm。Ⅴ級(jí):劃分標(biāo)準(zhǔn) d＞22.5 cm，試材規(guī)格d=4～7 cm。進(jìn)行人工模擬低溫脅迫處理的葉片系從樹(shù)冠外圍中部采取的新鮮葉片，要求生長(zhǎng)良好，長(zhǎng)勢(shì)基本一致，無(wú)病蟲(chóng)害。

1.2 方法

新鮮葉片分別用自來(lái)水、蒸餾水沖洗，用吸水紙吸干水分。每立木級(jí)葉片各分出6組置于密封塑料袋內(nèi)，將其中1組置于25℃室溫做對(duì)照，其他5組放入冷卻循環(huán)水浴儀。樣品于15℃預(yù)冷5 h，降溫至10℃預(yù)冷7 h。再?gòu)?0℃開(kāi)始進(jìn)行降溫，每次降溫5℃，即10℃→5℃，在5℃停留2 h后，取出第1組樣品，然后繼續(xù)降溫至0℃，停留2 h后再取出第2組樣品，依此類推，直至溫度降至-15℃。將低溫處理結(jié)束后取出的樣品放置于4℃冰箱內(nèi)解凍恢復(fù)2 h后，待測(cè)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

用電導(dǎo)法測(cè)相對(duì)電導(dǎo)率;氮藍(lán)四唑法測(cè)SOD活性;蒽酮比色法測(cè)可溶性糖含量;考馬斯亮藍(lán)法測(cè)可溶性蛋白含量;愈創(chuàng)木酚法測(cè)POD活性［9-10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 電導(dǎo)率

由圖1可以看出，5種立木級(jí)木荷的相對(duì)電導(dǎo)率都隨處理溫度的下降呈明顯的“S”型曲線，且均在-5℃時(shí)值最小。其中，Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)在5℃降至0℃時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率小幅升高，隨著溫度降至-5℃，略有下降，在 -5℃降至最低，后持續(xù)升高;Ⅰ級(jí)、Ⅳ級(jí)、Ⅴ級(jí)變化趨勢(shì)一致，輕度低溫脅迫 (5～0℃)時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率緩慢降低，在-5℃時(shí)降至最低，后快速升高。

對(duì)低溫處理下不同立木級(jí)木荷葉片的相對(duì)電導(dǎo)率進(jìn)行多重比較 (表1)，表明，Ⅱ級(jí)、Ⅳ級(jí)的相對(duì)電導(dǎo)率沒(méi)有顯著差異，而其他立木級(jí)間相對(duì)電導(dǎo)率差異顯著;Ⅲ級(jí)木荷的相對(duì)電導(dǎo)率與其他4種立木級(jí)木荷的相對(duì)電導(dǎo)率存在極顯著差異，Ⅰ級(jí)與Ⅴ級(jí)沒(méi)有極顯著差異。

圖1 低溫處理對(duì)5種立木級(jí)木荷葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

表1 低溫處理后木荷不同立木級(jí)間抗寒指標(biāo)的多重比較

對(duì)不同低溫處理下木荷葉片的相對(duì)電導(dǎo)率進(jìn)行多重比較 (表2)表明，所有處理溫度下木荷葉片的相對(duì)電導(dǎo)率與常溫對(duì)照相比都有極顯著差異，不同的處理溫度之間也存在極顯著差異。

表2 不同溫度處理木荷葉片抗寒性指標(biāo)的多重比較

綜合來(lái)看，木荷的細(xì)胞電解質(zhì)外滲率隨著溫度的降低而升高，有時(shí)出現(xiàn)電解質(zhì)外滲率降低的現(xiàn)象，說(shuō)明木荷的抗寒機(jī)制可在一定程度上修復(fù)細(xì)胞膜系統(tǒng)，但是恢復(fù)作用有限，如果脅迫加重，并不能阻止電解質(zhì)的外滲加劇。值得注意的是，在處理溫度降至-10℃后，Ⅰ級(jí)木荷相對(duì)電導(dǎo)率增長(zhǎng)趨于停滯，其他4種立木級(jí)木荷的相對(duì)電導(dǎo)率增長(zhǎng)趨緩，可能是因?yàn)槟竞傻目购佬l(wèi)作用漸趨極限，細(xì)胞膜發(fā)生不可逆的損傷，細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓趨于平衡所致。由此推測(cè)，如果溫度繼續(xù)降低，5種立木級(jí)木荷的細(xì)胞外滲率可能都會(huì)達(dá)到極值而不再增加。

2.2 超氧化物歧化酶 (SOD)活性

如圖2所示，Ⅰ級(jí)木荷SOD活性隨處理溫度的降低，先升后降，于-10℃時(shí)達(dá)到峰值;Ⅱ級(jí)木荷SOD活性先升高，在-5℃略降后繼續(xù)升高;Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)、Ⅴ級(jí)木荷的SOD活性均隨處理溫度的降低持續(xù)升高。低溫處理后，5種立木級(jí)木荷的SOD活性差異極顯著，Ⅰ級(jí)木荷的SOD活性極顯著高于其他立木級(jí)，Ⅲ級(jí)木荷的SOD活性極顯著低于其他立木級(jí) (表1)。所有處理溫度下木荷的SOD活性均與常溫對(duì)照存在極顯著差異，不同的處理溫度之間也存在極顯著差異 (表2)。

綜合來(lái)看，木荷的SOD活性隨處理溫度的降低大體呈上升趨勢(shì)，但是，升勢(shì)緩慢，Ⅰ級(jí)木荷在低于-10℃時(shí)SOD活性甚至下降，說(shuō)明木荷通過(guò)提高SOD活性來(lái)對(duì)抗低溫脅迫是有限度的，低溫脅迫嚴(yán)重到一定程度，SOD活性很可能開(kāi)始下降。

圖2 低溫處理對(duì)5種立木級(jí)木荷SOD活性的影響

2.3 POD活性

如圖3所示，Ⅰ級(jí)、Ⅳ級(jí)、Ⅴ級(jí)木荷葉片的POD活性均隨處理溫度的降低先升后降，其中，Ⅰ級(jí)在-5℃達(dá)到峰值，Ⅳ級(jí)、Ⅴ級(jí)在-10℃達(dá)到峰值;Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)呈現(xiàn)“S”型變化，均在0℃時(shí)活性最低，-10℃活性最高。Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)木荷葉片的POD活性無(wú)顯著差異，極顯著高于其他立木級(jí)木荷;其他立木級(jí)間差異極顯著，其中，Ⅰ級(jí)木荷葉片的POD活性極顯著低于其他立木級(jí) (表1)。低溫處理的所有溫度均與常溫對(duì)照差異極顯著，不同的處理溫度之間也存在極顯著差異(表2)。

綜合來(lái)看，雖然拐點(diǎn)溫度不盡相同，但是當(dāng)溫度降到一定程度時(shí)，5種立木級(jí)木荷的POD活性均出現(xiàn)由升轉(zhuǎn)降的現(xiàn)象，說(shuō)明輕度低溫會(huì)誘導(dǎo)木荷提高POD活性，但是，嚴(yán)重低溫會(huì)導(dǎo)致木荷的POD活性降低。

圖3 低溫處理對(duì)5種立木級(jí)木荷POD活性的影響

2.4 可溶性蛋白含量

如圖4所示，5種立木級(jí)木荷可溶性蛋白含量對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)呈較一致的變化趨勢(shì)，大體上先降后升，均在0℃時(shí)取得最小值。不同立木級(jí)木荷可溶性蛋白含量差異極顯著;Ⅲ級(jí)木荷的可溶性蛋白含量極顯著高于其他立木級(jí)，Ⅴ級(jí)木荷葉片的可溶性蛋白含量極顯著低于其他立木級(jí) (表1)。低溫處理的各個(gè)溫度均與常溫對(duì)照的可溶性蛋白含量差異極顯著，且不同處理溫度之間的可溶性蛋白含量也差異極顯著 (表2)。

綜合來(lái)看，隨處理溫度的降低，木荷葉片的可溶性蛋白含量均先減少再增加。前期的低溫處理中，可溶性蛋白的減少，說(shuō)明木荷通過(guò)增加蛋白質(zhì)含量對(duì)抗低溫的機(jī)制需要一定低溫的誘導(dǎo)，在溫度未達(dá)到需要的低溫時(shí)，可溶性蛋白含量是減少的。

圖4 低溫處理對(duì)5種立木級(jí)木荷可溶性蛋白含量的影響

2.5 可溶性糖含量

如圖5所示，Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)木荷可溶性糖含量隨溫度的降低緩慢減少，在-10℃時(shí)達(dá)到最小值后略有回升;Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)、Ⅴ級(jí)的可溶性糖含量以0℃為拐點(diǎn)，先降后升。經(jīng)低溫處理，Ⅲ級(jí)與Ⅳ級(jí)可溶性糖含量差異不顯著;而其他立木級(jí)間差異顯著，其中，Ⅳ級(jí)與Ⅴ級(jí)、Ⅳ級(jí)與Ⅲ級(jí)無(wú)極顯著差異，而與Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)差異極顯著;Ⅰ級(jí)的可溶性糖含量極顯著低于其他立木級(jí) (表1)。所有處理溫度的可溶性糖含量均極顯著大于常溫對(duì)照。0℃與-5℃時(shí)，可溶性糖含量無(wú)顯著差異 (表2)。

圖5 低溫處理對(duì)5種立木級(jí)木荷可溶性糖含量的影響

綜合來(lái)看，在輕度低溫脅迫 (常溫 -5℃)時(shí)，5種立木級(jí)木荷的可溶性糖含量都大幅增高，隨著溫度繼續(xù)降低，變化趨緩，增減均不顯著。說(shuō)明，木荷在輕度低溫脅迫時(shí)，積累可溶性糖的能力較強(qiáng)，而隨著溫度進(jìn)一步降低，積累可溶性糖的機(jī)制受阻。

3 小結(jié)

與常溫對(duì)照相比，低溫處理下5種立木級(jí)木荷的SOD活性、POD活性、可溶性蛋白含量整體呈上升趨勢(shì)，可溶性糖含量均顯著高于常溫對(duì)照，但隨著溫度的變化不顯著。Ⅰ級(jí)木荷葉片相對(duì)電導(dǎo)率最大，SOD活性最高，POD活性、可溶性糖含量最低;Ⅱ級(jí)木荷葉片相對(duì)電導(dǎo)率最小;Ⅲ級(jí)POD活性、可溶性蛋白含量最高，SOD活性最低;Ⅴ級(jí)可溶性糖含量最高，可溶性蛋白含量最低。說(shuō)明不同立木級(jí)木荷對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)差異極大，各有側(cè)重。

綜合來(lái)看，隨處理溫度的降低，木荷SOD活性與POD活性變化幅度差異很大，但變化趨勢(shì)較一致，說(shuō)明在木荷的抗寒機(jī)制中，SOD與POD是協(xié)同作用的。輕度低溫脅迫時(shí)，木荷通過(guò)積累可溶性糖來(lái)提高抗寒性，低溫脅迫較嚴(yán)重時(shí)，則通過(guò)可溶性蛋白的積累來(lái)提高抗寒性。

木荷不同的生理指標(biāo)對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)差異顯著，不同立木級(jí)同一生理指標(biāo)對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)呈現(xiàn)較一致的變化規(guī)律，但變化幅度差別很大。說(shuō)明不同立木級(jí)木荷的抗寒防衛(wèi)機(jī)制相同，但單因素的調(diào)節(jié)能力因立木級(jí)的不同而存在顯著差異。所有的指標(biāo)均在低溫脅迫到一定程度時(shí)，變化趨緩。說(shuō)明木荷的抗寒機(jī)能有其極限，只能在一定程度上減輕低溫對(duì)植物體的傷害。

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