黔不同產(chǎn)地苗藥黑骨藤的質(zhì)量分析

王文春 李 江 楊 陽

(貴陽中醫(yī)學院，貴州 貴陽 550002)

黑骨藤為蘿藦科杠柳屬植物黑龍骨Periploca forrestii Schltr.的干燥根或全株。主產(chǎn)于西南的貴州等地，該屬植物全世界共12種，我國產(chǎn)4種，均為藥用植物，主要分布在西南地區(qū)［1－3］。黑骨藤被貴州省藥材標準收載的一種苗藥，為貴州十大苗藥之一，其全株入藥，具有通經(jīng)、活血、解毒、祛風的功效，主治風濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、胃痛、消化不良、閉經(jīng)、痢疾等［3－6］，是民間廣泛應(yīng)用于治療閉合性軟組織損傷、風濕與類風濕等疾病的民族藥［2－4］;有研究［7］表明苗藥黑骨藤藥效與黃酮含量在一定的范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，黃酮含量越高，抗炎作用越明顯。隨著對黑骨藤研究的不斷深入，特別是在風濕性關(guān)節(jié)炎、閉合性軟組織損傷、風濕痹痛、腰椎骨質(zhì)增生等方面的廣泛應(yīng)用，使其需求量逐年增大。為了評價黑骨藤質(zhì)量的優(yōu)劣，我們以槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷為指標，采用高效液相色譜法(HPLC)測定黑骨藤中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的含量，從而為全面評價黑骨藤藥材質(zhì)量提供參考依據(jù)，為合理開發(fā)利用黑骨藤藥材資源提供基本資料。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：島津LC－20AT高效液相色譜儀DAD紫外檢測器、威瑪龍色譜工作站、AE/240型電子天平(上海梅勒儀器有限公司)、AVY220型電子天平(日本島津)、SK8210HP型超聲波清洗機(上?？茖x器有限公司)。

1.2 試藥：槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷對照品(天津馬克生物技術(shù)有限公司)，黑骨藤藥材分別采至貴州貴陽(烏當下壩、香紙溝)、興義、安順、凱里等地，并經(jīng)貴陽中醫(yī)學院藥學院孫慶文老師鑒定為正品，陰干。甲醇(分析純，95%)，甲醇(色譜純，批號111663)，水(娃哈哈純凈水，批號121700)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：Hypersil－C18色譜柱(4.6mm ×250mm，5μm) ，甲醇：水(33：67)為流動相，流速為 1mL/min－1，檢測波長370nm，柱溫25℃，進樣量10μL。在上述色譜條件下槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷與其他組分分離度良好。

2.2 對照品溶液的制備：精密稱取槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷對照品10.16mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻;精密吸取該對照品液1mL至10mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.02mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備：將藥材粉碎，取本品中粉2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液50mL，稱定，加熱回流提取2h，放冷，用甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45μm的微孔濾膜，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關(guān)系考察：精密稱取經(jīng)減壓干燥至恒重的槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷對照品1.27mg置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL含槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷0.127mg的對照品液。精密吸取該對照品溶液 2，4，6，8，10，12μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，其結(jié)果見表1。以對照品的進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積值Y為縱坐標，繪制標準曲線。求回歸方程，看其線性關(guān)系是否良好。

經(jīng)計算的槲皮素－3－o－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的回歸方程為：Y=1.0E+6X －21142，r=0.9999。實驗結(jié)果表明：槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷在0.254～1.524μg有良好的線性關(guān)系。

圖2 黑骨藤樣品及對照品HPLC A.對照品 B.樣品

2.4.2 精密度實驗：精密吸取上述槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷對照品液10μL，按上述色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，計算平均相對標準偏差，結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗結(jié)果(n=5)

實驗結(jié)果表明：槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷RSD為2.97%，說明該方法及儀器具有良好的精密度。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗：取同一批號樣品 ，按供試品溶液的制備方法操作，分別于0，2，4，8，12，24 h精密吸取10μL進樣，測得槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷峰面積。結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=6)

實驗結(jié)果表明：槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷RSD為1.56%，說明樣品至少在24小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復性試驗：取同一批號樣品6份，分別制備供試液，測得槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷平均質(zhì)量分數(shù)，其結(jié)果見表4。

表4 重復性試驗結(jié)果(n=6)

實驗結(jié)果表明：槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷RSD為0.07%，說明測量方法的重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗：采用加樣回收法，取已知含量的樣品，精密稱定，分別精密加入一定量的槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按上述測定方法進行測定，計算回收率，其結(jié)果見表5。

加樣回收率=(測得量—原有量)/加入量×100%

表5 加樣回收率測定結(jié)果(n=6)

實驗結(jié)果表明：RSD為1.51%，說明所建立的方法加樣回收率較高，符合含量測定要求。

2.4.6 樣品中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的含量測定：取5批藥材樣品，按照上述含量測定方法測定，測定結(jié)果，其結(jié)果見表6。

表6 含量測定結(jié)果(n=5)

實驗結(jié)果表明：所采的5批黑骨藤藥材中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的平均含量為0.2288mgμg－1，其中貴陽香紙溝黑骨藤中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷含量最高，含量為0.2410mgμg－1;興義黑骨藤中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷含量最低，含量為 0.2195mgμg－1。

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 流動相的選擇：黑骨藤中含有多種化學成分，如黃酮類、生物堿類、內(nèi)酯類、三萜類等多種活性成分，成分較為復雜［8］，為色譜條件的篩選增加不少難度。我們在本實驗研究中考查了甲醇－水、乙腈－水不同比例的流動相，以甲醇－水(33：67)作為流動相得到比較為滿意的結(jié)果。

3.1.2 檢測波長的選擇：根據(jù)文獻及用二極管陣列檢測器從190～400nm進行光譜掃描，槲皮素3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷對照品在370 nm處有最大吸收，故選擇370 nm為檢測波長。

3.2 提取方法和條件的選擇

3.2.1 提取方法的選擇：方法學考察過程中，對超聲處理、加熱回流及冷浸的提取方法進行了比較試驗，結(jié)果表明加熱回流提取法效果優(yōu)于其他兩種方法，故選用加熱回流法制備本實驗用樣品溶液。

3.2.2 提取溶劑的選擇：根據(jù)槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的溶解性選用甲醇、乙醇作為提取溶媒，進行選擇，并對30%甲醇、50%甲醇、純甲醇、無水乙醇、50% 乙醇進行了比較試驗，結(jié)果表明提取溶媒為純甲醇時干擾較少，效果優(yōu)于其他溶劑提取，故選用提取溶媒為甲醇。

3.2.3 提取時間的選擇：確定選用回流提取法，甲醇為提取溶媒后，分別又對回流1，1.5，2，2.5，3 h進行了比較試驗，結(jié)果表明回流提取2 h即能較完全提取出黑骨藤中的槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷，故選用回流提取2 h為樣品提取時間。

3.3 結(jié)論：采用本試驗所建立的方法測定了5批不同產(chǎn)地黑骨藤藥材中槲皮素－3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的含量，結(jié)果平均含量為0.2288mgμg－1，最低為興義產(chǎn)只有0.2195mgμg－1，最高為貴州貴陽市郊香紙溝產(chǎn)含量為0.2410mgμg－1，不同產(chǎn)地黑骨藤藥材中槲皮素 －3－O－α－L－吡喃阿拉伯糖苷的含量有明顯差異;一般黑骨藤喜生于陰濕的灌木叢中，我們意外發(fā)現(xiàn)生長在水分較少的石巖縫隙中的黑骨藤雖長勢欠佳，但內(nèi)部質(zhì)量較佳;為此，認為還需進一步探索。說明苗藥黑骨藤質(zhì)量受產(chǎn)地、環(huán)境、氣候、光照等的影響。

［1］貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準［M］.2003年版.貴陽：貴州科技出版社，2003：381.

［2］包駿，冉懋雄.貴州苗族醫(yī)藥研究與開發(fā)［M］.貴陽：貴州科技出版社，1999：188.

［3］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草(苗藥卷)［M］.貴陽：貴州科技出版社，2005：526.

［4］貴州植物志編輯委員會.貴州植物志(第四卷)［M］.成都：四川民族出版社，1989：493－509.

［5］江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典［M］.上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1986.

［6］貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準［S］.貴陽：貴州科技出版社，2003.

［7］張 宏，景小楠，于樹華，等.黑骨藤中總黃酮含量的測定［J］.四川師范大學學報(自然科學版)，2010，33(1)：93.

［8］王富花，郁建平.藥用植物黑骨藤化學成分研究初報［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學報，2008，27(6)：560.