CCK-8檢測GIK液對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用

劉龍燕，孟 偉，劉國燕，鄒學(xué)森，陳岳青，王春陽

(1、江西省腫瘤醫(yī)院檢驗科，江西 南昌330029;2、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科；3、江西省婦幼保健院)

CCK-8檢測GIK液對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用

劉龍燕1，孟 偉2，劉國燕3，鄒學(xué)森1，陳岳青1，王春陽1

(1、江西省腫瘤醫(yī)院檢驗科，江西 南昌330029;2、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科；3、江西省婦幼保健院)

目的研究GIK液的體外抗腫瘤作用。方法采用細(xì)胞毒性檢測CCK-8法檢測GIK液對人宮頸鱗癌細(xì)胞株(SiHa)的體外抑制作用。結(jié)果GIK液對SiHa的半數(shù)抑制濃度IC50為293.30μg/ml。結(jié)論不同濃度的GIK液在體外對腫瘤細(xì)胞有不同程度的生長抑制作用，且呈濃度依賴關(guān)系。

GIK；體外；抗腫瘤

GIK液(glucose-insulin-potassium)俗稱極化液是由葡萄糖、胰島素和氯化鉀組成的細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)制劑，用于缺血性心臟病輔助治療已有40多年的歷史，其療效越來越得到肯定[1，2]。作為心血管內(nèi)科的一種“老藥新用”，科學(xué)合理配置葡萄糖與胰島素的比值，不僅不會出現(xiàn)因輸入胰島素引起低血糖，而且還能為機(jī)體提供能源物質(zhì)。近年研究發(fā)現(xiàn)，胰島素受體廣泛存在于心臟、肝臟、子宮等器官的組織細(xì)胞，外源性胰島素與其受體結(jié)合直接發(fā)揮保護(hù)器官和組織的作用。此外，國內(nèi)外最近基礎(chǔ)研究表明，過去主要用于降血糖治療的內(nèi)源性激素胰島素，不僅是一種重要的內(nèi)源性抗炎因子[3]，而且還是一種重要的生長調(diào)節(jié)因子[4]。

宮頸癌是全球女性中僅次于乳腺癌的常見惡性腫瘤[5]，目前，宮頸癌的治療手段主要為手術(shù)結(jié)合放療、化療，眾所周知，手術(shù)創(chuàng)傷大，而放、化療毒副作用強(qiáng)，在臨床治療中尋求一種既能減輕抗腫瘤治療的毒副作用又能不干擾其療效的輔助用藥迫在眉睫。GIK作為一種輔助用藥在腫瘤治療中，具有較好的應(yīng)用前景。本文采用細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑(Cell Counting-Kit8,CCK-8)法對GIK的細(xì)胞毒性作用進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步開展GIK的體內(nèi)抗腫瘤作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 酶標(biāo)儀購自雷博公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自三洋公司；超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備廠；臺式離心機(jī)購自長沙相儀離心機(jī)儀器有限公司；生物顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司；細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑CCK-8購自日本株式會社；腫瘤細(xì)胞株(SiHa)由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理教研室提供；GIK液配制所需藥物均有本單位藥房提供；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自NEURONBC公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清購自GIBCO公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 GIK液配置 參照文獻(xiàn)[2]用等滲鹽水配制含葡萄糖、胰島素(武漢生物試劑有限公司)和氯化鉀終濃度分別為100g/L、80U/L、5g/L的GIK液。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 腫瘤細(xì)胞用含10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，于 37℃，5%CO2培養(yǎng)，用 0.25%胰酶-0.02%EDTA消化，傳代，收集增殖旺盛、狀態(tài)良好的細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮后，計數(shù)腫瘤細(xì)胞，調(diào)整腫瘤細(xì)胞濃度為200μl，懸液中含有細(xì)胞數(shù)為4000。

1.2.3 腫瘤細(xì)胞懸浮液包被96孔板，每孔200μl，4h后，加入不同濃度的GIK液10μl,藥物設(shè)有60、120、240、480 和 960μg/ml五個濃度， 每個濃度設(shè)有5個平行復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h后加入 10μl的 CCK-8試劑，37℃孵育 2h，測定 490nm光密度，同時設(shè)以腫瘤細(xì)胞和藥物為對照。

2 結(jié)果

通過測得的光密度值，計算出藥物對相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的抑制率，抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。 實驗結(jié)果見表1、表2、圖1。

結(jié)果可以看出：體外試驗中，GIK液對SiHa細(xì)胞具有抑制生長的作用，但不同濃度的藥物在同一時間對SiHa細(xì)胞的抑制作用不盡相同，其中在240μg濃度時對SiHa細(xì)胞具有明顯的抑制作用，960μg對SiHa的抑制作用達(dá)到90%以上。GIK液對SiHa細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50為293.30μg/ml。

表1 GIK液對人宮頸癌細(xì)胞生長的影響(n=5,±s)

表1 GIK液對人宮頸癌細(xì)胞生長的影響(n=5,±s)

*P<0.001與未加藥物的細(xì)胞組相比有顯著性差異。

未加藥60細(xì)胞GIK藥物濃度(μg/ml)120 240 480 960 48h OD值(490nm) 0.574±0.060 0.536±0.053 0.514±0.064 0.329±0.026* 0.099±0.015* 0.062±0.017*

表2 GIK液對人宮頸癌細(xì)胞抑制率的影響（n=5,±s）

表2 GIK液對人宮頸癌細(xì)胞抑制率的影響（n=5,±s）

*P<0.001與未加藥物的細(xì)胞組相比有顯著性差異

60 120 240 480 960 IC50(μg/ml)抑制百分率（%） 6.8±1.77 10.5±1.32 43.2±1.961* 82.8±1.632* 90.8±0.582* 293.30±21 GIK藥物濃度(μg/ml)

圖1 GIK液對人宮頸癌細(xì)胞抑制率的影響

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡的抑制以及細(xì)胞增殖和分化異常密切相關(guān)。研究進(jìn)展表明：腫瘤共性的生物學(xué)特征是失控性生長，可以說腫瘤是細(xì)胞失控性生長所致的一類細(xì)胞周期性疾病。腫瘤細(xì)胞的特征之一是異常增殖，目前的抗腫瘤藥物都是以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來達(dá)到治療腫瘤的目的，但因為腫瘤是全身的疾病，抗腫瘤藥物在治療的同時大都伴有一定程度的副作用如：脫發(fā)、惡心、嘔吐等，讓病人苦不堪言。在臨床化療輔助用藥的目的是為了減輕病人使用抗腫瘤藥物時的反應(yīng)，使抗腫瘤藥物最大限度的發(fā)揮其抗腫瘤的效果。但是化療輔助用藥的治療成本較高，讓大多數(shù)患者難以承受。

作為一種輔助用藥GIK液使用安全，治療成本低，國內(nèi)外目前對GIK液的研究主要是在心血管和創(chuàng)傷領(lǐng)域[6,7]，在腫瘤領(lǐng)域應(yīng)用目前還是一片空白，鑒于胰島素受體廣泛存在于人體各個器官的特點，本文作者大膽提出其對腫瘤細(xì)胞也具有抑制作用，本文實驗了解其在體外對腫瘤細(xì)胞的抑制殺滅作用，計算了IC50值，初步顯示GIK液對腫瘤細(xì)胞的體外抑制作用，GIK液對機(jī)體免疫功能、血液流變以及腫瘤細(xì)胞凋亡的影響有待進(jìn)一步研究。

本文采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，與常用的MTT法相比，無需有機(jī)溶劑，步驟少，操作簡單，無損失，結(jié)果準(zhǔn)確，是一種更加方便的細(xì)胞毒性/增殖檢測方法。

[1]Rojas Perez EM,Luna Ortiz P,Serrano Valdez X,et al.Glucoseinsulin-potassium(GIK)solution:Cardioprotective effects of insulin[J].Arch Cardiol Mex.2006,76 Suppl 4:S144-151.

[2]錢學(xué)賢.極化液、胰島素保護(hù)缺血/再灌注的新機(jī)制―又一個老藥新觀點的典范[J].中華內(nèi)科雜志,2003,42:145-147

[3]Quinn DW,Pagano D,Bonser RS,et al.Glucose and insulin influences on heart and brain in cardiac surgery[J].J Semin Cardiothorac Vasc Anesth,2005,9(2):173-178.

[4]Liu Y,Zhang X,Zhang Z,et al.The influence of topical application of insulin on the formation of basement membrane in scalded rats[J].Zhong Hua Shao Shang Za Zhi,2005,21(6):445-447.

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[6]Li J,Wu F,Zhang H,et al.Insulin inhibits leukocyteendothelium adherence via an Akt-NO-dependent mechanism in myocardial ischemia/reperfusion[J].Mol Cell Cardiol,2009,47:512-519.

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Detecting the tumor cell growth inhibiting activity of GIK liquid using cell counting-kit 8.

LIU Longyan，MENG Wei,LIU Guoyan,et al.Laboratory Department， Tumor Hospital of Jiangxi Province,Nanchang 330029,China

ObjectiveTo study the anti-tumor effects of glucose-insulin-potassium (GIK)solution.MethodsCCK-8 assay was used to detect the cell growth inhibiting activity of GIK on human cervical squamous cell carcinoma cell line (SiHa).ResultsThe half inhibitory concentration (IC50)of GIK to SiHa cells is 293.30μg/ml.ConclusionDifferent concentrations of GIK solution in vitro have different growth inhibiting effects on tumor cells,and this is does-dependent.

GIK；In vitro；Anti-tumor

R73-35+1,R737.33,R73-36+2

A

1674-1129(2012)05-0430-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.05.004

江西省衛(wèi)生廳課題(編號：20081279)

劉龍燕，女，1978年12月出生，畢業(yè)于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)碩士，研究方向：GIK液在婦科腫瘤治療中的輔助作用。通信作者：鄒學(xué)森tom445x@126.com