響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵菜籽蛋白的提取工藝研究

王曉凡，熊光權(quán)，汪 蘭，王海濱

(1.武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023;2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北武漢430064)

油菜在世界油料作物產(chǎn)量中位居前三。20世紀80年代以來，我國的油菜種植面積和產(chǎn)量都穩(wěn)居世界第一位，菜籽中約含21%—24%的蛋白［1］。菜籽蛋白是指油菜籽榨油后從菜籽餅中提取的蛋白質(zhì)，菜籽餅中蛋白質(zhì)含量在30%—40%［2］，雖然本身營養(yǎng)價值較高，是一種潛在的優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源，但由于其中還含有較多的硫甙和植酸等抗營養(yǎng)因子，因而大大限制了其在飼料、食品等行業(yè)的利用程度。筆者以自制的多菌種復(fù)合固態(tài)發(fā)酵脫毒后的菜籽粕為原料，初步探索發(fā)酵菜籽蛋白的優(yōu)化提取工藝，對發(fā)酵菜籽蛋白資源的開發(fā)利用具有重要意義。

本文利用傳統(tǒng)簡便的堿提酸沉的方法提取發(fā)酵菜籽蛋白，并用響應(yīng)面分析法優(yōu)化各個影響因素的提取條件，主要研究了pH值、溫度、料液比3個因素對發(fā)酵菜籽蛋白提取率的影響，以期為發(fā)酵菜籽蛋白的進一步開發(fā)利用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

菜籽粕由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所提供，經(jīng)多菌種復(fù)合固態(tài)發(fā)酵后得到本試驗的原料即發(fā)酵菜籽粕。發(fā)酵菜籽粕的主要成分見表1。

表1 發(fā)酵菜籽粕的主要成分 /%

1.2 儀器設(shè)備

數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：GZX-9070ME，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;分析天平：AL204，METTLER TOLEDO;馬弗爐：DRZ-4型，上海實驗電爐廠;分光光度計：715型，上海分析儀器廠。

1.3 發(fā)酵菜籽蛋白提取工藝研究

1.3.1 堿提酸沉工藝［3］

稱取一定量的發(fā)酵菜籽粕，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度、料液比、pH值三個參數(shù)，攪拌20 min浸提3次后靜置，將料液進行3500 r/min離心20 min后取上清液。上清液用0.5 mol/L HCl分別調(diào)節(jié)pH值到3.8和5.8，再分別離心20 min，將沉淀調(diào)至中性后冷凍干燥，即得發(fā)酵菜籽蛋白。

式中，W0為上清液中發(fā)酵菜籽蛋白質(zhì)質(zhì)量，W1為發(fā)酵菜籽粕中總蛋白質(zhì)量。

1.3.2 響應(yīng)面法對堿提發(fā)酵菜籽蛋白條件的優(yōu)化［4-6］

結(jié)合各個影響因子的單因素試驗結(jié)果，對pH值、溫度、料液比3個因素進行因素水平試驗的優(yōu)化設(shè)計，利用專業(yè)軟件Designer—Expert 7.0進行數(shù)據(jù)擬合處理，試驗因素水平見表2。

表2 發(fā)酵菜籽蛋白提取工藝試驗因素水平

1.3.3 酸沉發(fā)酵菜籽蛋白的優(yōu)化

選取調(diào)節(jié)pH2.8—7.8，對提取出的發(fā)酵菜籽蛋白溶液進行沉淀，以發(fā)酵菜籽蛋白的沉淀率為指標進行參數(shù)優(yōu)化。

式中，W0為上清液中發(fā)酵菜籽蛋白質(zhì)質(zhì)量［7］，W2為發(fā)酵菜籽蛋白制品的質(zhì)量。

1.4 測定方法

蛋白含量的測定：采用凱氏定氮法，參照GB/T 9823-2008。

水分含量的測定：采用常壓干燥法，參照GB/T 5009.3-2003。

脂肪含量的測定：采用索氏提取法，參照GB/T 5009.6-2003。

灰分的測定：采用碳化灼燒法，參照 GB/T 5009.4-2003。

硫甙含量的測定：氯化鈀分光光度計法［8］。

植酸含量的測定：三氯化鐵比色法［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取條件對發(fā)酵菜籽蛋白提取率的影響

2.1.1 不同提取pH值對發(fā)酵菜籽蛋白提取率的影響

由圖1可知，發(fā)酵菜籽蛋白的提取率隨pH值的升高而升高。pH值為13時發(fā)酵菜籽蛋白提取率可達到53.15%，這是因為在堿性環(huán)境中發(fā)酵菜籽蛋白與水的親合力較強。pH值大于13時，提取液逐漸變暗出現(xiàn)黑色，是發(fā)酵菜籽蛋白在強堿溶液中變性［5］。在所選pH值范圍內(nèi)，pH值為13時發(fā)酵菜籽蛋白的提取效果較理想。

圖1 pH值對發(fā)酵菜籽蛋白提取率的影響

2.1.2 不同提取溫度對發(fā)酵菜籽蛋白提取率的影響

圖2 溫度對發(fā)酵菜籽蛋白提取率的影響

由圖2可知，發(fā)酵菜籽蛋白的提取率剛開始是隨溫度上升而增加，在55℃時發(fā)酵菜籽蛋白的提取率達到最大值，由于溫度升高，發(fā)酵菜籽蛋白的分子運動加劇而使蛋白提取率明顯增大。55℃之后發(fā)酵菜籽蛋白的提取率下降可能因為溫度過高，發(fā)酵菜籽蛋白發(fā)生變性［5］。所以在所選溫度范圍內(nèi)，在55℃時提取發(fā)酵菜籽蛋白的效果最好。

2.1.3 不同料液比對發(fā)酵菜籽蛋白提取率的影響

由圖3可知，發(fā)酵菜籽蛋白的提取率隨著料液比的增大而增加，在料液比l∶15時提取率達到最大值。在l∶15以后，發(fā)酵菜籽蛋白的提取率會逐漸下降，這是因為料液比過大會將一些堿溶性非蛋白和水溶性蛋白物質(zhì)溶解出來［5］。所以在所選料液比范圍內(nèi)，料液比為l∶15時發(fā)酵菜籽蛋白的提取效果最為理想。

圖3 料液比對發(fā)酵菜籽蛋白提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法對堿提發(fā)酵菜籽蛋白的條件優(yōu)化

綜合考慮發(fā)酵菜籽蛋白提取率與經(jīng)濟效益之間的關(guān)系，響應(yīng)面法優(yōu)化試驗只考察pH值、溫度和料液比3個因素對發(fā)酵菜籽蛋白提取率的影響。以pH值(Z1)、溫度(Z2)、料液比(Z3)為自變量，以發(fā)酵菜籽蛋白的提取率為響應(yīng)值進行響應(yīng)面優(yōu)化分析，試驗結(jié)果見表3。方差分析表明R2=0.9947，此時回歸方程達到極顯著水平(P＜0.001)。將所得試驗數(shù)據(jù)做數(shù)學(xué)模型擬合，獲得發(fā)酵菜籽蛋白提取率與溫度(B)、pH(A)值和料液比(C)的回歸方程如下：

表3 發(fā)酵菜籽蛋白提取工藝的響應(yīng)面設(shè)計和結(jié)果

分別取pH值、溫度和料液比為零水平，考察其余2個因素的交互作用對發(fā)酵菜籽蛋白的提取率的影響，各個因素交互作用的響應(yīng)面見圖4—圖6。由各圖的曲面變化率可以清晰地看出，pH值對發(fā)酵菜籽蛋白提取率的影響最為顯著，料液比和溫度次之。經(jīng)過專業(yè)軟件分析回歸方程得到：在pH值12.4，溫度55.7℃，料液比為1∶16.2時，發(fā)酵菜籽蛋白的提取率達到最大，為64.79%。此試驗設(shè)計的中心值與優(yōu)化所得的反應(yīng)條件比較相近。并且此時兩者發(fā)酵菜籽蛋白的提取率也比較接近，這表明此回歸方程能夠較好地反映出pH值、溫度和料液比與發(fā)酵菜籽蛋白提取率的變化關(guān)系。

圖4 pH值和溫度對發(fā)酵菜籽蛋白提取率的交互影響

圖5 pH值和料液比對發(fā)酵菜籽蛋白提取率的交互影響

圖6 溫度和料液比對發(fā)酵菜籽蛋白提取率的交互影響

2.3 酸沉發(fā)酵菜籽蛋白的優(yōu)化

選用pH2.8—7.8對提取出的發(fā)酵菜籽蛋白溶液進行沉淀，其沉淀率的變化如圖7所示。由圖7可知，在pH3.8和pH5.8時發(fā)酵菜籽蛋白的沉淀率最高，都超過69%，因此我們采用pH3.8和pH值5.8的兩步沉淀法來制備發(fā)酵菜籽蛋白，分別沉淀不同等電點的發(fā)酵菜籽蛋白，從而達到分離純化的目的。

圖7 不同pH值下的發(fā)酵菜籽蛋白沉淀率

3 結(jié)論

(1)本試驗利用堿提酸沉的方法初步探索了發(fā)酵菜籽蛋白的提取工藝。分別從pH值、溫度和料液比3個因素進行了單因素分析，得出了發(fā)酵菜籽蛋白提取的最佳工藝條件，即：pH值12，溫度55℃，料液比1∶15，提取時間為20 min，提取次數(shù)為3次。

(2)在各個單因素試驗的基礎(chǔ)上，筆者又對pH值、溫度和料液比3個因素進行響應(yīng)面優(yōu)化分析，確定了提取發(fā)酵菜籽蛋白的最佳條件，即在pH值12.4，溫度55.7℃，料液比為1∶16.2時，發(fā)酵菜籽蛋白的提取率達到最大值。

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