在線微載體肝細(xì)胞熒光示蹤研究

劉 勇，汪 艷，夏武政，周煥城，高 毅，4

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北十堰 442000;2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)研究所;3.廣東省人民醫(yī)院普外科;4.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院肝膽二科

在線微載體肝細(xì)胞熒光示蹤研究

劉 勇1，2，汪 艷2，夏武政3，周煥城2，高 毅2，4

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北十堰 442000;2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)研究所;3.廣東省人民醫(yī)院普外科;4.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院肝膽二科

目的擬探討SYTO/EB在微載體細(xì)胞培養(yǎng)中活體細(xì)胞原位示蹤的應(yīng)用價(jià)值。方法采用活細(xì)胞核酸染色劑(SYTO13)和溴化乙啶(EB)2種核酸染色劑對(duì)微載體生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行雙重染色，熒光顯微鏡下通過顏色不同判斷細(xì)胞的活力狀態(tài)并計(jì)算出活力百分比。以間接活力測(cè)定的四氮唑鹽法同時(shí)對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行活力的檢測(cè)，并將結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果2種方法測(cè)定的結(jié)果均可顯示微載體生長(zhǎng)的肝細(xì)胞。但SYTO/EB法更靈敏，可精確計(jì)數(shù)。結(jié)論SYTO/EB測(cè)定微載體肝細(xì)胞的活力快速、靈敏且簡(jiǎn)便，并可原位觀察細(xì)胞的活力，不失為一種可取的微載體活力檢測(cè)方法。

微載體;染色;活細(xì)胞

微載體廣泛被用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)中。一系列新型的微載體如多孔微載體被研發(fā)，投入到細(xì)胞培養(yǎng)、疫苗生產(chǎn)等［1-4］。但目前應(yīng)用的微載體特別是多孔微載體，由于透光性，而難以在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)采用常規(guī)顯微鏡觀察到細(xì)胞分布、細(xì)胞形態(tài)和活力。多孔微載體呈黃褐色，因而不易將細(xì)胞同背景區(qū)分［5］。支架內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞也難以觀察。常規(guī)使用的細(xì)胞活力染色劑如臺(tái)盼藍(lán)易將微載體一起染色，降低了區(qū)分度。MTT染色的黑色與背景黃褐色的區(qū)分度也不高［6-7］。尋找一種具有良好區(qū)分度，便于隨時(shí)觀察活體細(xì)胞的示蹤方法具有重要實(shí)際意義。活體細(xì)胞熒光染色已經(jīng)有成熟應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)。SYTO/EB是一種高性能熒光染色劑，能夠以不同的顏色區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞［8-14］。我們擬探討SYTO/EB在微載體細(xì)胞培養(yǎng)中活體細(xì)胞原位示蹤的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 CO2孵箱為Thermo Forma Model3111(美國(guó));熒光顯微鏡為 OLYMPUS相差顯微鏡(日本);電子照相系統(tǒng)為OLYMPUS照相系統(tǒng)(日本);其余試劑均為市售分析純產(chǎn)品。

1.2 主要藥品和試劑 SYTO 13購(gòu)自 Invitrogen公司(美國(guó))，EB購(gòu)自EHSY西域公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)方法，形態(tài)和活力的檢測(cè) Cl-1細(xì)胞采用MEM培養(yǎng)基 ，置孵箱中，37℃、飽和濕度、5%CO2、95%空氣，14～20 r/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，第一個(gè)24 h換液1次，此后每48 h換液1次直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每次換液80%。HepFIMMU采用1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)方法同上。每天換液前后在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化。

1.3.1 MTT法:MTT是一種水溶性四唑鹽，在缺乏酚紅時(shí)，接觸培養(yǎng)基或鹽溶液后呈黃色。但當(dāng)脫氫酶破壞四唑環(huán)時(shí)，轉(zhuǎn)變成不可溶的紫色物?；钚约?xì)胞線粒體的脫氫酶可以促使MTT轉(zhuǎn)變成不可溶的紫色的甲暨，從而可與死細(xì)胞相區(qū)分。不可溶的甲暨溶于異丙醇，在一定波長(zhǎng)下產(chǎn)生一定的吸光度，并與濃度呈量效關(guān)系。MTT細(xì)胞檢測(cè)方法如下:將50 mg MTT溶于10 mL PBS，然后過濾滅菌，4℃下避光保存。檢測(cè)時(shí)將10 μL MTT溶液加到置有100 μL細(xì)胞懸液的96孔平板中，或直接加到富集的細(xì)胞單層中。然后將樣品在37℃孵育2 h，繼之培養(yǎng)基被移除，加入100 μL異丙醇。搖勻樣本直至黑藍(lán)色的甲暨完全溶解。

1.3.2 SYTO/EB熒光染色法:SYTO 13是一種活細(xì)胞核酸染料。EB在細(xì)胞壁損傷時(shí)才能進(jìn)入細(xì)胞，與核酸結(jié)合形成紅色的復(fù)合物。SYTO 13進(jìn)入活細(xì)胞，與核酸結(jié)合，并在紫外線下發(fā)出綠色熒光。與其他SYTO染料相比，SYTO 13的穿透力最強(qiáng)。SYTO 13和EB的配制:SYTO 13以1.25 mmol的BME溶液保存于－20℃冰箱中。配制SYTO 13和EB混合液時(shí)添加100 μL EB和10 μL SYTO于1 mL的MEM培養(yǎng)基中。微載體檢測(cè):從微載體溶混懸液中均勻振蕩后提取2 mL液體，放置到15 mL塑料離心管中。靜置后拋棄上清，加入SYTO 13和EB混合液，在室溫下孵育2 min。然后PBS清洗兩次，置于有凹面標(biāo)本架的載玻片，覆蓋蓋玻片后在熒光顯微鏡下觀察

1.4 圖像分析 采用IMAGINE PRO PLUS軟件進(jìn)行分析。不同熒光相片的合并:①先調(diào)整圖像對(duì)比及亮度，分別轉(zhuǎn)換成灰度圖片。② 對(duì)其中一張進(jìn)行co-localization操作，以合成雙熒光相片。

1.5 統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量 步驟如下:① 打開 IMAGINE PRO PLUS。②導(dǎo)入待分析圖片。③ 點(diǎn)擊count/size工具，在彈出的窗口中選中automatic bright objects，再點(diǎn)擊count。調(diào)出statistics窗口就可以看到自動(dòng)計(jì)數(shù)結(jié)果了。④ 數(shù)據(jù)過濾:調(diào)出 count/size中的 select measurement窗口，點(diǎn)擊中間filt range窗口中的area。再點(diǎn)擊下面的edit range按紐，調(diào)出edit range窗口，選擇合適的上限和下限。⑤統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù):記錄過濾后的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.6 光密度強(qiáng)度時(shí)間曲線繪制 分別選擇微載體上熒光強(qiáng)度最強(qiáng)和MTT染色最深的細(xì)胞，采用IMAGEINE PRO PLUS測(cè)量光密度值，并制作光密度強(qiáng)度時(shí)間曲線，比較SYTO/EB法與MTT法的差異。

1.7 形態(tài)學(xué)觀察 每天換液前后在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 微載體培養(yǎng)細(xì)胞的熒光染色結(jié)果 SYTO/EB法可以清晰顯示Cytodex 3微載體單個(gè)細(xì)胞。綠色為活細(xì)胞，紅色為死細(xì)胞。MTT法可以顯示活細(xì)胞，但不能清楚的區(qū)別單個(gè)細(xì)胞，不能計(jì)數(shù)，無法區(qū)分死活細(xì)胞(見圖1、圖2)。

2.2 SYTO/EB法的準(zhǔn)確性 微載體及細(xì)胞分為處理組和對(duì)照組。處理組經(jīng)75%乙醇浸泡半小時(shí)，對(duì)照組不加以干預(yù)，然后SYTO/EB法染色觀察。治療組細(xì)胞均呈紅色，而對(duì)照組均呈黃綠色。提示SYTO/EB法能很好的區(qū)分死活細(xì)胞。MTT法的結(jié)果類似，提示對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的滅活處理是成功的(見圖1、圖2)。

2.3 SYTO/EB法光密度時(shí)間曲線圖及不同時(shí)間的顯像圖 隨時(shí)間延長(zhǎng)，SYTO/EB法的熒光強(qiáng)度也相應(yīng)改變。SYTO值逐漸減弱，EB值逐漸增強(qiáng)(見圖3)。

圖3 SYTO/EB法光密度時(shí)間曲線圖Fig3 Diagram of curves of optical density and time by SYTO/EB method

2.4 微載體細(xì)胞計(jì)數(shù) 各種支架材料對(duì)細(xì)胞的相容性差異很大，Cytodex 3的細(xì)胞培養(yǎng)能力最小(80～120)，次之為Cytopore(150～190)，最高為絲素支架(160 ～180)，與文獻(xiàn)報(bào)道相近［3，15-16］，表明所采用計(jì)數(shù)方法可靠性高。

3 討論

20世紀(jì)50年代合成溴化乙錠(3，82二氨基262乙基252苯基菲啶嗡溴化物)是為尋找菲啶類化合物作為有效的抗錐蟲藥，溴化乙錠是篩選過程中最成功的化合物［17］。除了在獸醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用外，溴化乙錠在分子克隆的發(fā)展中起到了重要的作用，低濃度溴化乙錠染色作為檢測(cè)瓊脂糖電泳中的微量DNA的經(jīng)典方法，沿用至今已有20余年，其也被作為常規(guī)核酸染色劑廣泛用于細(xì)胞的計(jì)數(shù)檢測(cè)，溴化乙錠在這些方面的應(yīng)用主要得益于其熒光性質(zhì)和嵌入雙鏈DNA堿基的能力。但EB的分子量較大，不能自由穿過細(xì)胞膜，只有在細(xì)胞死亡或細(xì)胞損傷細(xì)胞膜出現(xiàn)裂隙時(shí)才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與DNA結(jié)合，在一定的激發(fā)和發(fā)射光譜下發(fā)出紅色熒光［18-19］。SYTO 13核酸染色劑是一種新的穿透性核酸染色劑，該染色劑可穿透活細(xì)胞膜，與核酸DNA/RNA相結(jié)合，在一定的激發(fā)和發(fā)射光譜下發(fā)出綠色熒光。根據(jù)這兩種核酸染料的這兩個(gè)性質(zhì)，可以分辨出染色后微載體培養(yǎng)的肝細(xì)胞的活力狀態(tài)，再通過圖像分析軟件計(jì)算出活細(xì)胞的百分比。

本研究證明SYTO 13/EB法染色用于在線微載體檢測(cè)細(xì)胞活力具有顯著優(yōu)勢(shì):① 步驟簡(jiǎn)單快捷，整個(gè)步驟僅需要幾分鐘;②與MTT染色相比，細(xì)胞活力可以顯示到單個(gè)細(xì)胞;③便于圖像分析軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)等分析。SYTO 13/EB法可以直接觀察到微載體上培養(yǎng)細(xì)胞的活力狀態(tài)，染色時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便，并可以定量分析，優(yōu)于傳統(tǒng)的MTT法，應(yīng)作為微載體培養(yǎng)細(xì)胞的首選活力評(píng)價(jià)法。

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Improved microscopic observation of mammalian cells on microcarriers by fluorescent staining

LIU Yong1，2，WANG Yan2，XIA Wuzheng3，ZHOU Huancheng2，GAO Yi2，4
1.Department of Intensive Care Unit Renmin Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000;2.Institute for Regeneration Medicine，Zhujiang Hospital，Southern Medical University;3.Department of General Surgery，Guangdong Provincial People’s Hospital;4.Second Department of Hepatobiliary，Zhujiang Hospital，Southern Medical University，China

ObjectiveTo develop an assay for viability detection of liver cell cultured on the Cytodex 3 in situ.MethodsTwo nucleic acid dyes，SYTO 13 and ethidium bromide(EB)were used to assess the viability of liver cells.Cells were stained with SYTO 13/EB.The viability of cells was determined by fluorescence microscope，and compared with MTT assay.ResultsAlthough the cell number and morphology could be clearly seen with the Cytodex 3，but cells viability could not be discerned.No cell was obviously visible inside the gelatin beads，although some cells were seen on the external surface in MTT assay.When cells were cultivated as aggregates，this FDA/EB staining technique could also be applied to such a system.High viability could be seen in large clumps of cells.ConclusionThis staining technique is to be simple，quick and reliable when used in microcarrier liver cell culture.This technique has been applied to a number of microcarrier.The use of this technique with macroporous microcarriers makes it a potential visualization technique in other immobilized mammalian cell systems.

Microcarrier;Staining;Living cells

Q813

A

1006－5709(2012)04－0328－03

2011-10-33

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.04.011

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2006AA02A141);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2007A032100005)

劉勇，副主任醫(yī)師，主要研究方向:危重病，E-mail:liuyongjoy@hotmail.com

高毅，教授，主任醫(yī)師。E-mail:gaoyi6146@163.com