舟山近海條石鯛野生群體與人工放流群體遺傳多樣性的AFLP分析

李三磊, 徐冬冬 樓 寶 王偉定 辛 儉 毛國(guó)民 詹 煒

(1. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所, 浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 舟山 316100; 2. 浙江海洋學(xué)院, 浙江 舟山316004)

舟山近海條石鯛野生群體與人工放流群體遺傳多樣性的AFLP分析

李三磊1,2, 徐冬冬1, 樓 寶1, 王偉定1, 辛 儉1, 毛國(guó)民1, 詹 煒1

(1. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所, 浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 舟山 316100; 2. 浙江海洋學(xué)院, 浙江 舟山316004)

利用 AFLP技術(shù)對(duì)舟山近海條石鯛(Oplegnathus fasciatus)野生和放流群體的遺傳多樣性進(jìn)行比較分析, 旨在為條石鯛的人工增殖及其種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供遺傳學(xué)的基礎(chǔ)資料。采用 8對(duì)引物組合在2個(gè)群體中共擴(kuò)增得到位點(diǎn)316個(gè), 多態(tài)性位點(diǎn)為162個(gè), 多態(tài)性比例為51.67%。野生群體和放流群體的多態(tài)性位點(diǎn)比例(P), Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s多樣性指數(shù)(I)分別為46.75%和44.67%, 0.097和 0.089, 0.16和 0.15。野生群體的遺傳多樣性水平略高于放流群體, 但差異并不顯著(P＞0.05)。兩群體間的遺傳相似系數(shù)(S)和遺傳距離(D)分別為0.99和0.0073; 基因分化系數(shù)(Gst)為0.036,群體間無(wú)顯著遺傳分化(P＞0.05)。分子方差(AMOVA)分析表明96.82%的遺傳變異來(lái)源于群體內(nèi)的個(gè)體間, 群體間無(wú)顯著的遺傳差異(P＞0.05)。以上研究結(jié)果表明條石鯛的放流群體與野生群體間無(wú)明顯的遺傳分化, 放流群體的遺傳多樣性水平尚處于一個(gè)合理狀態(tài)。但為了避免放流群體對(duì)野生群體產(chǎn)生負(fù)面的遺傳效應(yīng), 應(yīng)當(dāng)增加放流群體繁育親本的數(shù)量, 并對(duì)放流群體的遺傳變異水平進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)。

條石鯛(Oplegnathus fasciatus); 野生群體; 人工放流群體; 遺傳多樣性; AFLP

針對(duì)目前海洋漁業(yè)資源衰退現(xiàn)狀, 世界各國(guó)政府均實(shí)施積極的資源養(yǎng)護(hù)和漁業(yè)管理措施, 優(yōu)化漁業(yè)資源結(jié)構(gòu), 改善海域生態(tài)環(huán)境, 恢復(fù)日趨衰退的海洋漁業(yè)資源。其中, 人工增殖放流是恢復(fù)漁業(yè)資源最為直接有效的措施。但是, 增殖放流的苗種來(lái)自于人工繁育, 從保護(hù)生態(tài)學(xué)角度來(lái)看, 由于放養(yǎng)魚類與野生魚類之間存在遺傳差異, 可能對(duì)自然群體產(chǎn)生負(fù)面影響, 使魚類基因庫(kù)的遺傳變異降低, 從而直接影響到野生群體的遺傳多樣性水平[1-2]。

一直以來(lái), 養(yǎng)殖群體對(duì)野生群體的遺傳效應(yīng)備受研究人員關(guān)注, 因放養(yǎng)而導(dǎo)致的負(fù)面遺傳影響的證據(jù)日益增多。在大西洋鮭中, 多代連續(xù)的人工養(yǎng)殖造成養(yǎng)殖群體 42%的等位基因丟失, 當(dāng)這些苗種放流或逃逸到自然界時(shí), 對(duì)野生群體的遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響, 導(dǎo)致野生群體的數(shù)量降低[3-4]。日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)條斑星鰈(Verasper moseri)放流回捕群體的遺傳變異水平和有效群體大小較低, 具有引起近交衰退的風(fēng)險(xiǎn)[5]。中國(guó)學(xué)者吳旭等[6]研究發(fā)現(xiàn), 肖四海湖野生和放流的鱖群體的遺傳結(jié)構(gòu)存在顯著分化。Fritzner等[7]研究認(rèn)為, 為避免人工增殖群體與野生群體的基因庫(kù)混雜, 在實(shí)施增殖時(shí), 應(yīng)對(duì)人工放流群體進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)估, 從而確保野生群體的遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。因此, 采用適當(dāng)、適時(shí)監(jiān)控, 研究放流群體與野生群體的遺傳異質(zhì)性, 了解放流物種資源的遺傳結(jié)構(gòu)及其遺傳多樣性狀況, 對(duì)評(píng)估增殖放流效果、豐富海洋生物的遺傳學(xué)背景資料具有著重要的作用。

條石鯛(Oplegnathus fasciatus), 隸屬于鱸形目(Perciformes)、石鯛科(Oplegnathidae)、石鯛屬(Oplegnathus), 俗稱日本鸚鵡魚, 自然分布于太平洋和印度洋沿岸, 中國(guó)產(chǎn)于黃海、東海和臺(tái)灣海峽, 是一種暖溫性海洋中下層的島礁性魚類[8-9]。近年來(lái),由于環(huán)境污染、氣候條件變化及過(guò)渡捕撈等原因, 造成包括條石鯛在內(nèi)的野生經(jīng)濟(jì)魚類資源急劇衰退。條石鯛被農(nóng)業(yè)部確定為重要的人工增殖放流品種,自 2006年起連續(xù)多年在舟山海域進(jìn)行人工增殖放流。目前, 有關(guān)條石鯛的研究主要涉及早期發(fā)育[10-11]、人工繁育[12]及養(yǎng)殖[13-14]等方面。關(guān)于其群體遺傳學(xué)的研究報(bào)道僅見(jiàn)于孫鵬等[15-16]利用線粒體控制區(qū)域序列分析技術(shù)研究了條石鯛單一性群體的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)。有關(guān)條石鯛野生群體和人工放流群體的遺傳多樣性的比較分析尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用 AFLP技術(shù)對(duì)舟山近海的條石鯛野生群體和放流群體的遺傳多樣性進(jìn)行比較分析, 探討野生群體和放流群體的遺傳差異, 為條石鯛人工增殖提供科學(xué)指導(dǎo), 并為其種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供遺傳學(xué)的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的一個(gè)條石鯛群體于2005年采自舟山附近海區(qū), 取樣前未曾進(jìn)行條石鯛的人工放流活動(dòng),故所取樣本可以認(rèn)定為野生群體, 共 30尾, 平均體長(zhǎng)為18.35 cm±1.32 cm。另一個(gè)群體為人工放流群體,由舟山市水產(chǎn)研究所于2010年人工繁育所得, 共30尾, 平均體長(zhǎng)為5.53 cm±0.52 cm。人工放流群體的親魚為舟山嵊泗附近海域放流前捕獲的野生魚馴養(yǎng)而成, 共32尾, 雌性與雄性的比例約為2 ：1。對(duì)采集樣本取肌肉或尾鰭, –20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

基因組DNA采用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取(TIANGEN, 北京), 然后用 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 并利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定 DNA濃度和純度, 用雙蒸水稀釋至50 mg/L備用。

1.3 AFLP分析

AFLP分析參照Vos等[17]的方法。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 選取選擇性引物組合 E-AAC/ M-CTC、E-AAC/M-CTG、E-ACA/ M-CAT、E-ACA/ M-CTT、E-ACC/M-CAT、E-ACC/ M-CTT、E-AGA/ M-CAT 和 E-AGA/M-CTT用于AFLP分析。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染顯色, 將獲得清晰條帶的膠板進(jìn)行拍照并記錄結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

根據(jù)電泳圖譜中擴(kuò)增條帶的有無(wú)分別記錄為“1”和“0”, 所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后形成矩陣, 統(tǒng)計(jì)多態(tài)性位點(diǎn)數(shù), 計(jì)算顯性基因型頻率等參數(shù)。利用Popgen1.32[18]軟件計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)比例 (P)、Shannon’s多樣性指數(shù) (I)[19]、Nei’s[20]基因多樣性指數(shù) (H)、Nei’s[21]遺傳距離 (D) 及遺傳相似系數(shù) (S)、Nei’s[22]基因分化系數(shù) (Gst) 等遺傳參數(shù), 利用 Arlequin3.1[23]軟件進(jìn)行 AMOVA分析?；趥€(gè)體間的遺傳距離, 利用Mega3.1[24]軟件構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴(kuò)增結(jié)果

利用篩選出的 8對(duì)選擇性引物組合, 在兩個(gè)群體的60個(gè)個(gè)體中共得到316個(gè)清晰位點(diǎn), 其中多態(tài)性位點(diǎn)為162個(gè), 多態(tài)性比例為51.67%(圖1)。不同引物的擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)從33到52不等, 擴(kuò)增出的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為 14～28不等, 檢出的多態(tài)性比例范圍為38.89%～68.29% (表1)。野生和放流群體中分別擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為144個(gè)和134個(gè), 多態(tài)性比例分別為46.75%和44.67%, 野生群體中擴(kuò)增的多態(tài)性比例略高于人工放流群體, 但差異并不顯著 (df =1,χ2=0.23,P＞0.05)。

圖1 引物組合E-AGA/M-CTT擴(kuò)增得到的條石鯛AFLP指紋圖譜Fig. 1 AFLP patterns of Oplegnathus fasciatus using primer set E-AGA/M-CTT

2.2 野生群體與放流群體的遺傳變異分析

條石鯛野生群體與放流群體的 Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和 Shannon’s多樣性指數(shù)(I)分別為 0.097和 0.089, 0.16和0.15(表2)。野生群體的 Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和 Shannon’s多樣性指數(shù)(I)略高于放流群體。兩群體間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離分別為0.99和0.0073, 基因分化系數(shù)Gst為0.036, 兩群體間無(wú)顯著遺傳分化(P＞0.05); AMOVA分析結(jié)果表明96.82%的遺傳變異來(lái)源于群體內(nèi)的個(gè)體間, 僅有3.16%的遺傳變異來(lái)自群體間, 兩群體間無(wú)顯著遺傳差異 (P＞0.05, 表3)。

表1 不同引物組合的擴(kuò)增結(jié)果Tab. 1 Amplification results of different primer combinations

表2 條石鯛兩個(gè)群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab. 2 Parameters of genetic diversity in two populations of Oplegnathus fasciatus

表3 條石鯛兩個(gè)群體遺傳變異的AMOVA分析Tab. 3 Analysis of molecular variance (AMOVA) in two populations of Oplegnathus fasciatus

將 316個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)的顯性基因型頻率以 10%為單位劃分區(qū)間, 0和100%分別設(shè)為一個(gè)單獨(dú)的區(qū)間,共劃分12個(gè)區(qū)間, 統(tǒng)計(jì)顯性基因型頻率位于各區(qū)間內(nèi)的位點(diǎn)數(shù)。結(jié)果顯示, 兩個(gè)群體擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)在不同顯性基因型頻率區(qū)間的分布呈現(xiàn)一定的規(guī)律, 反映了兩個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)特點(diǎn) (圖2)。野生群體在1%～9%區(qū)間的擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)呈現(xiàn)峰值, 放流群體在20%～29%區(qū)間的擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)呈現(xiàn)峰值, 兩個(gè)群體在30%～100%區(qū)間的擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)分布變化趨勢(shì)基本一致。從擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)在不同顯性基因頻率區(qū)間的分布來(lái)看, 放流群體的低頻率顯性位點(diǎn)數(shù)比野生群體的少, 表明野生群體的顯性基因頻率分布相對(duì)放流群

2.3 野生群體與放流群體的聚類分析

利用MEGA3.1軟件基于條石鯛60個(gè)個(gè)體間的遺傳距離, 構(gòu)建了UPGMA系統(tǒng)樹如圖3。系統(tǒng)樹結(jié)果顯示, 60個(gè)個(gè)體分為兩支, 兩個(gè)群體的個(gè)體分散于兩個(gè)分支, 沒(méi)有出現(xiàn)群體聚類的現(xiàn)象, 表明兩個(gè)群體沒(méi)有出現(xiàn)明顯的遺傳分化, 具有較近的親緣關(guān)系。

圖2 擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)在不同顯性基因頻率區(qū)間內(nèi)的分布Fig. 2 Distributions of amplified loci in different frequency of intervals

圖3 條石鯛60個(gè)個(gè)體的UPGMA聚類樹Fig. 3 UPGMA dendrogram of 60 individuals of Oplegnathus fasciatus

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用 8對(duì) AFLP選擇性引物組合對(duì)舟山近海條石鯛野生群體與人工放流群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析, 在 60個(gè)個(gè)體中共得到擴(kuò)增位點(diǎn) 362個(gè),不同引物組合擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)從33到52不等, 多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為14～28不等, 每對(duì)引物平均得到擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)分別約為40和20, AFLP標(biāo)記表現(xiàn)出了豐富的多態(tài)性和較高的靈敏度。

多態(tài)性位點(diǎn)比例(P)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和 Shannon’s多樣性指數(shù) (I) 是衡量群體遺傳多樣性的重要參數(shù), 反映了群體在數(shù)個(gè)基因座位上的遺傳變異, 其值大小可以反映群體遺傳變異的高低。本研究中, 條石鯛野生群體的多態(tài)性位點(diǎn)比例為46.75%, Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H) 和 Shannon’s多樣性指數(shù)(I)分別為0.097和0.16。與中國(guó)近海魚類現(xiàn)有的 AFLP分析數(shù)據(jù)相比, 條石鯛的遺傳多樣性水平較真鯛(Pagrus major) (P=58.4%～64.0%)[25]、小黃魚(Larimichthys polyactis) (P=55.34～60.09%,H=0.12～0.14)[26]、銀鯧 (Pampus argenteus) (P=62.9%～67.0%,I=0.23～0.25)[27]低, 與黃姑魚 (Nibea albiflora)(P=51.70%,H=0.10)[28]相當(dāng), 但較褐牙鲆(Paralich-thys olivaceus) (P=40.29～44.31%)[29]和 馬 鮫 魚(Scomberomorus niphonius) (P=38.54%～45.70%,H=0.081～0.098)[30]高。這表明條石鯛的野生群體的遺傳變異水平相對(duì)略高。孫鵬等[15]利用線粒體COⅠ基因和Cytb基因?qū)χ凵胶Ｓ虻臈l石鯛野生群體進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析也表明其野生群體具有較高的遺傳多樣性水平。這可能與海洋魚類的生境面積廣大且種群分布分散有關(guān)[26-28]。

物種的遺傳多樣性高低與其適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力密切相關(guān)。野生種群遺傳多樣性水平的減少可能導(dǎo)致魚類成活率、生長(zhǎng)與繁殖效率變低,降低種群個(gè)體對(duì)變化的環(huán)境的適應(yīng)能力[31]。由于放流的苗種來(lái)自人工養(yǎng)殖, 許多研究表明養(yǎng)殖群體的遺傳變異水平低于野生群體, 如大西洋鮭(Salmo salarL.)[3]、褐牙鲆[29,32]等, 因此, 放流苗種可能對(duì)野生群體產(chǎn)生負(fù)面的遺傳影響。本研究中, 比較條石鯛兩個(gè)群體的擴(kuò)增多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)比例(P)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和 Shannon’s多樣性指數(shù)(I)等參數(shù)發(fā)現(xiàn)野生群體的遺傳變異水平略高于放流群體, 但差異不顯著, 群體間無(wú)明顯的遺傳分化,這可能是由于人工放流群體的繁育親魚與野生群體來(lái)自同一海域有關(guān); 然而, 放流群體中1%～9%低頻位點(diǎn)數(shù)略低于野生群體, 這可視為隱性純合位點(diǎn)過(guò)剩, 稀有位點(diǎn)的丟失, 致使放流群體的遺傳多樣性水平會(huì)略低于野生群體, 這可能由于放流群體培育過(guò)程中親魚數(shù)量限制及繁殖過(guò)程中的一些不合理因素(如親魚大小、親魚雌雄比例、遺傳漂變等)所致[31-33]。條石鯛野生群體稀有位點(diǎn)對(duì)整個(gè)群體的遺傳變異水平影響不算大, 但對(duì)于整個(gè)基因庫(kù)卻很重要。因此, 對(duì)該條石鯛人工放流群體的遺傳多樣性水平處于一個(gè)合理狀態(tài)的現(xiàn)狀也不能過(guò)于樂(lè)觀。

人工增殖放流是快速恢復(fù)種群數(shù)量的有效方法,然而, 人工放流的遺傳效應(yīng)一直存在爭(zhēng)議。Gonzalez[34]研究發(fā)現(xiàn)：雖然近 30年的人工放流使日本海域黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)種群數(shù)量增加,但也導(dǎo)致其自然群體的遺傳變異水平有所下降。Kitada[35]對(duì)真鯛和太平洋鯡(Clupea pallasi)增殖放流的遺傳效應(yīng)進(jìn)行跟蹤研究, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)放流群體并未影響野生群體的遺傳多樣性。保證人工放流群體的遺傳多樣性水平可以避免其對(duì)野生群體遺傳危害。從種質(zhì)資源保護(hù)的角度出發(fā), 進(jìn)行人工放流時(shí)用于人工繁育的親本應(yīng)當(dāng)直接從自然群體中選擇, 不要采用養(yǎng)殖的子代作為親本, 且親本數(shù)量不宜過(guò)少,一般推薦的親本數(shù)量在50～350尾[31,36]。本研究中,條石鯛放流群體的親本與野生群體來(lái)自同一海域,且放流群體的遺傳多樣性水平尚處于較為合理的狀態(tài), 可能不會(huì)對(duì)野生群體的遺傳結(jié)構(gòu)造成影響。但為了避免放流群體對(duì)自然群體遺傳多樣性的負(fù)面影響,應(yīng)當(dāng)增加繁育親本的數(shù)量; 而且, 在今后的放流過(guò)程中要對(duì)放流群體的遺傳變異水平進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)。

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The genetic diversity of wild and hatchery-releasedOplegnathus fasciatusfrom inshore water of Zhoushan revealed by AFLP

LI San-lei1,2, XU Dong-dong1, LOU Bao1, WANG Wei-ding1, XIN Jian1,MAO Guo-min1, ZHAN Wei1
(1. Marine Fishery Institute of Zhejiang Province, Zhejiang Province Key Lab of Mariculture and Enhancement,Zhoushan 316100, China; 2. Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316004, China)

Apr.,18, 2011

Oplegnathus fasciatus; wild population; hatchery-released population; genetic diversity; AFLP

The genetic variations of wild and hatchery-releasedOplegnathus fasciatusfrom inshore water of Zhoushan were analyzed using amplified fragment length polymorphism (AFLP) to provide basic genetic information for the population enhancement and genetic resource protection and utilization in this fish species. A total of 316 loci were generated in the two populations using 8 primer combinations, among which 162 (51.67%) were polymorphic.The percentages of polymorphic loci in the wild or hatchery-released populations were 46.75% or 44.67%, respectively. The genetic diversities in terms of Nei’s gene diversity and Shannon’s diversity index in the wild population were 0.097 and 0.16, respectively. The corresponding values in hatchery-released population were 0.089 and 0.15,respectively. These results showed that the genetic diversity in the wild population was slightly higher than that in the hatchery-released population, but the difference in genetic diversity of the two populations was not significant(P＞0.05). The genetic similarity coefficient and genetic distance between the two populations were 0.99 and 0.0073,respectively. The value ofGst coefficient was 0.036, which indicated no significant genetic differentiation between the two populations (P＞0.05). The analysis of molecular variance (AMOVA) showed that 96.82% of the genetic variation occurred among individuals within populations, which also revealed no significant genetic variation between the two populations (P＞0.05). The genetic diversity of hatchery-released population was at a reasonable level of state and genetic differentiation was not significant between the wild and hatchery-released populations. It was noticeable to take approaches to avoid the potential negative genetic effects of hatchery-released on wild populations. The number of parental fish should increase and the genetic variation level of hatchery-released population ought to be continuously monitored in the future.

Q953 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-3096(2012)08-0021-07

2011-04-18;

2011-10-20

國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2011BAD13B08); 國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201005013); 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41106114); 浙江省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2010F20006); 浙江省海水養(yǎng)殖重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2010R50025)

李三磊(1985-), 男, 山東泰安人, 碩士, 主要從事魚類遺傳育種研究, 電話：0580-3050985, E-mail：sanjun198563@126.com; 樓寶,通信作者,電話：0580-3050985, E-mail：loubao6577@163.com

譚雪靜)