微小毛霉凝乳酶的分離純化研究

高維東，宋禮，紀(jì)銀莉，何瀟，張玉平，甘伯中

(1.甘肅華羚生物技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730000;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070)

凝乳酶是生產(chǎn)奶酪及凝乳酶干酪素中使牛乳凝固的關(guān)鍵性酶，它是一種天冬氨酸蛋白酶，其主要的生物學(xué)功能是限制性剪切酪蛋白Phe105～Met106之間的肽鍵，從而導(dǎo)致牛奶的凝結(jié)，因此被廣泛應(yīng)用于奶酪制造業(yè)和干酪素產(chǎn)業(yè)［1］。凝乳酶來(lái)源廣泛，在動(dòng)植物以及微生物中都有，傳統(tǒng)的凝乳酶來(lái)源于小牛的皺胃，但是隨著世界奶酪產(chǎn)業(yè)的不斷壯大，單純靠宰殺大量的小牛獲取凝乳酶顯然與現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展不相符，植物凝乳酶雖然來(lái)源廣泛，但是其蛋白水解力強(qiáng)，并且受時(shí)間、地點(diǎn)等的限制難以發(fā)展［2-3］，微生物生長(zhǎng)周期短，產(chǎn)量大，受氣候、地域、時(shí)間限制小，用其生產(chǎn)凝乳酶成本較低，酶提取方便，經(jīng)濟(jì)效益高。微生物凝乳酶從1965年起開(kāi)始取代小牛皺胃酶制造干酪以來(lái)，成功地彌補(bǔ)了小牛凝乳酶短缺的問(wèn)題［4］，并在奶酪制造業(yè)與干酪素產(chǎn)業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料與試劑微小毛酶HL-1，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所保藏菌株，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室紫外線和亞硝基胍誘變篩選得到;脫脂奶粉，完達(dá)山乳制品有限公司;標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，美國(guó)Sigma公司;其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基①斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯(去皮切塊)200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17.3 g，自來(lái)水1 000 mL。將馬鈴薯去皮切塊，加1 000 mL自來(lái)水，在電爐上80℃加熱1 h，用紗布過(guò)濾，補(bǔ)加自來(lái)水至1 000 mL，加入葡萄糖和瓊脂，加熱溶解，分裝，121℃高壓滅菌20 min待用［5］;②液體種子培養(yǎng)基:麩皮水解液30 mL，硝酸銨0.5 g，蔗糖1 g，磷酸二氫鉀0.2 g;③三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:粉碎后新鮮麩皮30 g、硝酸銨0.3 g和磷酸氫二鉀0.5 g加入到500 mL三角燒瓶?jī)?nèi)，按1∶0.8加入自來(lái)水，攪拌均勻，在121℃下滅菌25 min待用;④浸提液:0.85%的氯化鈉溶液［6-7］。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備UV2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本SHIMADZU;BIO-RAD垂直板電泳儀，美國(guó)BIO-RAD公司;恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司;超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司;超濾儀，美國(guó)Millipore公司;真空冷凍干燥機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器設(shè)備有限公司;純水機(jī)，重慶力德高端水處理設(shè)備有限公司;蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)AKTA purifier，美國(guó)GE醫(yī)療集團(tuán)公司。

1.2 方法

1.2.1 凝乳酶活力的測(cè)定方法Arima方法:用0.01 mol/L的氯化鈣液配制10%脫脂奶粉液，此溶液配制后在室溫放置40 min以上使用，當(dāng)天使用有效，不宜冰箱放置［8］。取5 mL 10%的脫脂奶粉液在35℃保溫10 min，加0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液(35℃保溫)，立即搖勻，開(kāi)始計(jì)時(shí)(凝乳時(shí)間控制在40～90 s)，并把試管傾斜45°以上。在水浴中震蕩試管，觀察壁上出現(xiàn)小顆粒為終點(diǎn)，記錄凝乳時(shí)間。在上述條件下，40 min凝1 mL 10%脫脂奶粉的酶量定義為一個(gè)Soxhlet單位(SU)［9］。

式中:2 400為40 min的凝乳時(shí)間，s;D為酶液稀釋倍數(shù);t為反應(yīng)時(shí)間。

1.2.2 凝乳酶制劑的制備方法將配置好的發(fā)酵培養(yǎng)基按14%接種，28℃下發(fā)酵72 h后待用。

1.2.3 浸提溫度對(duì)酶提取的影響分別在20、25、30、35、40、45℃下將發(fā)酵完全的培養(yǎng)基加入0.85%氯化鈉溶液里浸提12 h，除去固體物后測(cè)定凝乳酶活力。每個(gè)樣做3個(gè)平行試驗(yàn)，取平均值做結(jié)果分析。

1.2.4 浸提時(shí)間對(duì)酶提取的影響30℃下在浸提罐中加入0.85%氯化鈉溶液，分別浸提2、4、6、8、10、12、14 h，除去固形物測(cè)定凝乳酶的活力。每個(gè)樣做3個(gè)平行試驗(yàn)，取平均值做結(jié)果分析。

1.2.5 浸提液pH對(duì)酶提取的影響將0.85%氯化鈉溶液的pH分別調(diào)整為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在不同pH條件下浸提培養(yǎng)物10 h，除去固形物測(cè)定凝乳酶活力。每個(gè)樣做3個(gè)平行試驗(yàn)，取平均值做結(jié)果分析。

1.2.6 浸提液離子強(qiáng)度對(duì)酶提取的影響調(diào)整浸提液氯化鈉的濃度，分別配制濃度為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%的氯化鈉浸提液，浸提10 h，除去固形物測(cè)定凝乳酶活力。每個(gè)樣做3個(gè)平行試驗(yàn)，取平均值做結(jié)果分析。

1.2.7 浸提液加入比例對(duì)酶提取的影響分別按物料與浸提液質(zhì)量比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7加入浸提液，在30℃下提取10 h，除去固形物測(cè)定凝乳酶活力。每個(gè)樣做3個(gè)平行試驗(yàn)，取平均值做結(jié)果分析。

1.2.8 離心沉降對(duì)酶活力的影響浸提物以200目的濾布除去固形物，得到的粗酶液分別在6 000、8 000、10 000、12 000、14 000 r/min下離心10 min，測(cè)定離心后的上清液凝乳酶活力。每個(gè)樣做3個(gè)平行試驗(yàn)，取平均值做結(jié)果分析。

1.2.9 膜法對(duì)凝乳酶的純化離心后的粗酶液利用微濾及濃縮技術(shù)，經(jīng)過(guò)1 μm熔噴濾芯、1 μm PP折疊濾芯、0.2 μm PES折疊濾芯、0.45 μm PES折疊濾芯和0.45 μm PP折疊濾芯等5步過(guò)濾，除去發(fā)酵液中的培養(yǎng)基雜質(zhì)、菌絲體、菌體和部分大分子雜蛋白，實(shí)現(xiàn)了酶液的澄清，再經(jīng)過(guò)8 000分子量的超濾膜除去大量的水分，實(shí)現(xiàn)酶液的濃縮，測(cè)定酶活。

1.2.10 有機(jī)溶劑沉淀法對(duì)凝乳酶的純化離心后的粗酶液加乙醇(95%)，其比值為1∶0.6(體積比)，靜置4 h，離心取上清液加乙醇(95%)，其比值為1∶0.8(體積比)，靜置過(guò)夜，離心，沉淀用10倍體積pH 5.0的0.05 mol/L醋酸緩沖液溶解，測(cè)定酶活。

1.2.11 層析法對(duì)凝乳酶的純化利用美國(guó)通用醫(yī)療集團(tuán)的AKTAprocess蛋白質(zhì)層析儀，用S300和G100的填料進(jìn)行微小毛霉凝乳酶蛋白的分離純化，實(shí)現(xiàn)了凝乳酶蛋白的自動(dòng)化分離純化，分部收集，測(cè)定收集液酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸提溫度對(duì)酶提取的影響

由圖1可以看出，30℃浸提活力最高，酶活為5 450 U/mL。溫度過(guò)低，不利于酶從菌絲體及培養(yǎng)物基質(zhì)中釋放出來(lái)，溫度過(guò)高會(huì)對(duì)酶蛋白的熱穩(wěn)定性造成影響，同時(shí)易被微生物降解利用。

圖1 浸提溫度對(duì)酶提取的影響Fig.1 Effects of reaction temperature on enzyme extraction

2.2 浸提時(shí)間對(duì)酶提取的影響

由圖2可以看出，浸提10 h，浸提液凝乳酶活力較高，酶活為4 870 U/mL。隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，凝乳酶逐漸釋放到浸提液中，但由于酶蛋白的穩(wěn)定性及微生物的降解作用，活力從10 h后逐漸降低。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)酶提取的影響Fig.2 Effects of time on enzyme extraction

2.3 浸提液pH對(duì)酶提取的影響

由圖3可以看出，當(dāng)浸提液的pH值在6.5時(shí)，凝乳酶有較高的回收率，酶活為4 120 U/mL。微小毛酶凝乳酶的最適pH值為5.8左右，所以在酸性條件下浸提，更有利于微小毛霉凝乳酶的釋放。

圖3 浸提液pH值對(duì)酶提取的影響Fig.3 Effects of pH on the enzyme extraction

2.4 浸提液離子強(qiáng)度對(duì)酶提取的影響

由圖4可以看出，1%的氯化鈉有利于凝乳酶的提取，酶活為5 570 U/mL。當(dāng)氯化鈉濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，會(huì)偏離菌絲體的等滲點(diǎn)，阻礙凝乳酶的釋放。

2.5 浸提液加入比例對(duì)酶提取的影響

由圖5可以看出，1∶5的固液比有利于凝乳酶的提取，酶活為4 730 U/mL。固液比太低，不利于凝乳酶從菌絲體及基質(zhì)中釋放;固液比過(guò)高，酶濃度會(huì)降低造成酶活的降低，同時(shí)間接對(duì)后期酶的提取濃縮增加生產(chǎn)成本。

圖4 浸提液離子強(qiáng)度對(duì)酶提取的影響Fig.4 Effects of ion concentration on the enzyme extraction

圖5 固液比對(duì)酶提取的影響Fig.5 Effects of Solid-liquid ratio on the enzyme extraction

2.6 離心力對(duì)酶活力的影響

圖6 離心力對(duì)酶提取的影響Fig.6 Effects of Centrifugal force on the enzyme extraction

由圖6可以看出，10 000 r/min離心10 min凝乳酶的回收率最高，酶活為5 720 U/mL。離心力較低，雜質(zhì)及雜蛋白去除不完全，酶活較低。離心力過(guò)高，會(huì)造成部分酶蛋白的沉淀及損傷，酶活也不高。

2.7 膜法對(duì)凝乳酶的純化

經(jīng)過(guò)5次過(guò)濾，1次濃縮后，凝乳酶樣品濃縮8倍，活力提高約6倍，酶活為34 227 U/mL。由于除去了部分雜蛋白、小分子糖類、無(wú)機(jī)鹽及水，酶液酶活極大提高，但酶液通過(guò)濾芯和濾膜時(shí)，酶蛋白會(huì)有部分損傷，酶活提高倍數(shù)和濃縮倍數(shù)無(wú)明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。同時(shí)試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)濃縮倍數(shù)越高，酶蛋白損傷也就越大。試驗(yàn)中減少膜超濾時(shí)間，降低濃縮倍數(shù)，采用5倍濃縮粗酶液，酶活約提高了4.5倍，酶活為25 765 U/mL。

2.8 有機(jī)溶劑沉淀法對(duì)凝乳酶的純化

經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑浸提后，樣品濃縮50倍，活力提高約17倍，酶活為97 543 U/mL。通過(guò)沉淀法得到凝乳酶溶液，濃縮倍數(shù)及酶活比膜過(guò)濾法純化凝乳酶都有所提高，但從濃縮倍數(shù)及活力提高倍數(shù)對(duì)應(yīng)關(guān)系可以看到，有機(jī)溶劑沉淀法對(duì)酶活損失也較大。由于有機(jī)溶劑的使用量大，在后期工業(yè)化應(yīng)用中，有機(jī)溶劑的回收及安全使用必成為工業(yè)化推廣著重考慮的問(wèn)題。

2.9 層析法對(duì)凝乳酶的分離提純

圖7 層析法對(duì)凝乳酶的分離提純Fig.7 Chromatography for separation and purification of chymosin

利用AKTAprocess蛋白質(zhì)層析儀層析樣品后，由圖7可以看出，凝乳酶的保留時(shí)間在110～130 min之間，分離純化后，凝乳酶蛋白純度達(dá)到95%以上，收集酶液酶活為52 786 U/mL。利用層析法獲得了較純的凝乳酶，粗酶液濃縮了15倍，凝乳酶酶活提高約10倍，酶活損失最小。與膜法對(duì)凝乳酶純化相比，層析對(duì)凝乳酶的純化效果較好，但層析處理量小，填料昂貴，不適合工業(yè)化推廣。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明微小毛霉(HL-1)凝乳酶的最適提取條件:浸提溫度30℃;浸提液pH 6.5;浸提時(shí)間10 h;浸提液氯化鈉濃度1%;物料與浸提液比例為1∶5;在10 000 r/min下離心10 min，粗酶液提取效果最好。95%的乙醇沉淀純化凝乳酶，濃縮倍數(shù)及酶活提高倍數(shù)較好，但工業(yè)化推廣中乙醇的安全使用及回收成本較高。層析純化凝乳酶，酶活損失最小，純化效果最好，但填料昂貴，處理量小，不適合工業(yè)化推廣。膜法純化凝乳酶，通過(guò)控制膜處理時(shí)間，降低濃縮倍數(shù)，酶活損失可以降到最小，適合工業(yè)化推廣。

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