益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang和Lactobacillus plantarum P8對全價飼料pH及微生物類群變化的研究

魏愛彬，于潔，王鑫，王宏梅，白娜，張和平

(內蒙古農業(yè)大學教育部乳品生物技術與工程重點實驗室，內蒙古呼和浩特010018)

益生菌是當攝入一定量時可以對宿主的健康起作用的微生物活體［1］。近20 a來，益生乳酸菌在養(yǎng)殖業(yè)中得到了廣泛的應用［2］。益生乳酸菌發(fā)酵全價飼料具有的諸多優(yōu)點使其得到越來越多的關注。大量研究證明，益生乳酸菌發(fā)酵過程中與飼料中雜菌競爭營養(yǎng)物質［3］，同時產生有機酸(乳酸、乙酸等)降低全價飼料的pH，產生具有抑菌或殺菌效果的肽抗生素，如細菌素，從而有效地抑制病原微生物的滋生，減少有害微生物的數量，并且能生成可以水解細菌毒素的酶類物質［4-5］。益生乳酸菌發(fā)酵后的全價飼料，具有良好的適口性，同時益生乳酸菌產生的各種促進動物消化吸收的活性物質，可以顯著地提高飼喂動物的生產性能［6-7］。另外，飼料中的益生乳酸菌活菌進入動物腸道后，使動物腸道中有益菌數量增加，促進腸道內形成有益優(yōu)勢菌群，從而競爭性抑制病原微生物增殖，保持腸道內微生態(tài)平衡，同時對機體的調節(jié)免疫產生積極影響，提高動物的免疫力［8-10］。Lactobacillus casei Zhang(L.casei Zhang)是分離自內蒙古地區(qū)傳統酸馬奶中的1株益生菌，經16S rDNA同源性分析與GeneBank中標準菌株L.casei ATCC334的同源性為100%［11］。經研究表明該菌株具有良好的耐酸性、人工胃腸液耐受性及膽鹽耐受性［12］，可以在小鼠腸道內定殖并起到拮抗病原菌的作用［13］，對小鼠的體液免疫、細胞免疫和腸黏膜局部免疫具有調節(jié)作用［14-16］。飼喂該菌體能顯著降低高脂血癥大鼠血清膽固醇和低密度脂蛋白含量［17］，有效提高小鼠血液中的免疫球蛋白G(IgG)及腸道分泌型免疫球蛋白(SIgA)水平，提高小鼠免疫力［18］，其乳酸菌液和發(fā)酵乳對雛雞免疫功能有促進作用［19］。Lactobacillus plantarum P8(L.plantarum P8)篩選自內蒙古農業(yè)大學乳酸菌菌種資源庫(LABCC)的102株植物乳桿菌中。L.plantarum P8在pH 2.5人工胃液中消化3 h，存活率為90.16%;pH 2.0人工胃液中消化3 h，存活率為42.85%，之后進入pH 8.0的人工腸液消化12 h，存活率為94.87%。L.plantarum P8在膽鹽濃度為0.3%～1.8%范圍內均具有耐受性。動物試驗證實L.plantarum P8具有降膽固醇降血脂的功效［20］。本試驗研究了以L.casei Zhang、L.plantarum P8單一菌種及復合菌種發(fā)酵全價飼料過程中pH及主要微生物類群的變化，為益生乳酸菌進一步在全價飼料中的應用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗材料L.casei Zhang和L.plantarum P8直投式發(fā)酵劑由內蒙古農業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供，其活菌數分別為11.30 lg cfu/g和11.60 lg cfu/g。140 mm×200 mm真空包裝袋(市售);全價飼料配方見表1。

表1 全價飼料組成(干物質基礎)Table 1 The composition of complete feed(dry basis)

1.1.2 主要試劑TaKaRa-PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(大連寶生物RNA反錄純化試劑盒)，TransStart Green qPCR SuperMix(北京全式金熒光定量試劑)，梭狀芽胞桿菌計數瓊脂培養(yǎng)基(青島日水生物技術有限公司)，Potato Dextro Agar培養(yǎng)基(Unipath Ltd)，MRS瓊脂培養(yǎng)基、大腸菌群大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

1.1.3 主要儀器pH計(雷磁PHS-3C，上海精密科學儀器有限公司)，無菌工作臺(NSC-ⅡA-1200，日本)，Eppendorf 5810高速冷凍離心機，ND-100微量紫外分光光度計，AB-Veriti PCR儀，AB-StepOne熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵全價飼料的制作向混合均勻的全價飼料中加入煮沸并冷卻至室溫的自來水，使飼料含水量達到40%。分別向全價飼料中接種L.casei Zhang與L.plantarum P8發(fā)酵劑(接種量見表2)，充分混勻。準確稱取50 g全價飼料于真空包裝袋中，將包裝袋壓實以盡量排空空氣，用封口機將包裝袋封口，25℃發(fā)酵。每組3個平行，并做空白對照試驗。

表2 L.casei Zhang與L.plantarum P8的接種量Table 2 The inoculation amount of L.casei Zhang and L.plamtarum P8

1.2.2 發(fā)酵全價飼料pH及活菌數的測定全價飼料25℃發(fā)酵期間，在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、10 d分別取樣測定其pH及活菌數，平行試驗重復3次，取平均值。①全價飼料微生物活菌數的測定:從密封袋中準確稱取10 g全價飼料樣品于裝有玻璃珠的250 mL滅菌三角瓶中，加入90 g滅菌蒸餾水，置于搖床上160 r/min搖動15 min，取0.5 mL稀釋液用0.85%(質量體積比)滅菌生理鹽水梯度稀釋至一定倍數時，采用各選擇培養(yǎng)基，對乳酸菌、酵母菌、霉菌、大腸埃希菌、芽胞桿菌、梭狀芽胞桿菌計數。其中:乳酸菌的選擇培養(yǎng)，采用MRS瓊脂培養(yǎng)基，平板傾注，30℃厭氧培養(yǎng)48 h;酵母菌和霉菌的選擇培養(yǎng)，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(含0.09%的酒石酸)，涂布，30℃培養(yǎng)48 h;大腸埃希菌的選擇培養(yǎng)，采用大腸菌群大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基，涂布，30℃培養(yǎng)24 h;在對好氧細菌大腸埃希菌、酵母菌、霉菌以及乳酸菌進行微生物分析之后，將稀釋液在75℃加熱15 min之后，分別對芽胞桿菌和梭狀芽胞桿菌進行測定，其中芽胞桿菌采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，涂布，30℃培養(yǎng)48 h，梭狀芽胞桿菌采用梭狀芽胞桿菌計數瓊脂培養(yǎng)基，涂布，30℃厭氧培養(yǎng)48 h;②L.casei Zhang和L.plantarum P8活菌數的測定:對L.casei Zhang和L.plantarum P8活菌數的測定采用熒光定量PCR技術(RT-PCR)。a.樣品RNA的提取及cDNA的合成:準確稱取0.3 g攪拌均勻的全價飼料移入離心管中，洗滌處理，將洗脫的菌體于1.5 mL離心管中。按照Trizol試劑盒說明書提取樣品RNA，檢測RNA純度和濃度后，應用TaKaRa試劑盒于42℃水浴鍋中恒溫處理2 min去除基因組DNA，以提取純化的總RNA為模板，使用TaKaRa反轉錄試劑盒，將混勻的反應液放置在PCR儀中37℃保溫15 min，而后85℃加熱7 s，最后將反轉錄成的cDNA降溫至4℃保藏;b.L.casei Zhang和L.plantarum P8的特異性引物的設計及驗證:特異性引物的設計:以L.casei Zhang和L.plantarum P8的全基因組序列為依據，選取其中一段特異性片段設計引物，其中L.casei Zhang的引物序列為LcZ-F CCGACGTACCAGCTCACT;LcZ-RAAGACTATCAGATAGCGGCTCA。L.plantarum P8的引物序列為LpP-FACTAACGGGAGGAGTGAT;LpP-R GTCCCGATTTGAGAACTAT。特異性引物的驗證:應用以上設計的特異性引物，擴增Lactobacillus casei參考菌株和本實驗室乳酸菌菌種資源庫(LABCC)保藏的240株Lactobacillus casei菌株，同時擴增Lactobacillus plantarum參考菌株和本實驗室乳酸菌菌種資源庫(LABCC)保藏的347株Lactobacillus plantarum菌株，發(fā)現應用這2種特異性引物只能分別擴增出L.casei Zhang和L.plantarum P8，因此，引物特異性良好，可以用于后續(xù)L.casei Zhang和L.plantarum P8的定量試驗;c.標準品的制備和標準曲線的繪制:標準品的制備:提取L.casei Zhang和L.plantarum P8的宏基因組DNA，應用微量紫外分光光度計測定濃度，根據已知L.casei Zhang和L.plantarum P8的基因組片段長度，依據拷貝數計算公式計算出單位濃度的基因組DNA中所包含的L.casei Zhang和L.plantarum P8的個數，將此單位濃度的基因組DNA進行10倍系列稀釋并以此作為外標準品進行熒光定量PCR反應。標準曲線的繪制:以含有梯度稀釋個數的L.casei Zhang和L.plantarum P8宏基因組DNA陽性模板的對數為橫坐標，以PCR反應過程中到達熒光閾值的初始循環(huán)數(Ct)為縱坐標擴增得到L.casei Zhang和L.plantarum P8的定量擴增標準曲線，以此作為待測樣品中L.casei Zhang和L.plantarum P8數量測定的參照標準。標準曲線見圖1、2。d.L.casei Zhang和L.plantarum P8活菌數的測定:以待測樣品反轉錄的cDNA和標準品為模板，用L.casei Zhang和L.plantarum P8特異性引物進行熒光定量PCR擴增。反應參數:95℃20 s;40個循環(huán)，95℃5 s，65℃30 s，72℃40 s。將擴增結果和標準曲線比對計算出每克樣品中L.casei Zhang和L.plantarum P8的活菌數;③pH的測定:將取完樣的全價飼料10倍稀釋液置于磁力攪拌器上攪拌15 min，采用精密pH計測量。

圖1 L.casei Zhang的RT-PCR擴增標準曲線Fig.1 The quantitative real-time PCR standard curve of L.casei Zhang

圖2 L.plantarum P8的RT-PCR擴增標準曲線Fig.2 The quantitative real-time PCR standard curve of L.plantarum P8

1.2.3 數據統計分析試驗數據采用SAS ANOVA 9.0程序進行方差分析，P＜0.05，采用origin 7.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 全價飼料發(fā)酵過程中pH的變化

25℃發(fā)酵過程中，單一菌種和復合菌種發(fā)酵的全價飼料樣品pH變化見圖3。與對照組相比，益生乳酸菌發(fā)酵飼料的pH持續(xù)降低，L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組及復合菌種發(fā)酵組在發(fā)酵1 d后pH呈現明顯的下降趨勢，在發(fā)酵10 d時pH分別達到4.24和4.22。L.casei Zhang單一菌種發(fā)酵組則在2 d后呈現明顯下降趨勢，在發(fā)酵10 d時pH為4.23。

圖3 各組在發(fā)酵期間pH變化Fig.3 Changes of pH values in all groups during fermentation

2.2 發(fā)酵全價飼料發(fā)酵期間及貯藏期間微生物類群的變化

2.2.1 L.casei Zhang和L.plantarum P8的活菌數量變化試驗組中乳酸菌活菌數的變化結果見圖4。發(fā)酵期間，乳酸菌的活菌數逐漸升高。采用平板計數法對發(fā)酵飼料中的乳酸菌總數進行測定，乳酸菌總數結果顯示，發(fā)酵組中乳酸菌總數持續(xù)增長，其中L.casei Zhang、L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組和復合菌種發(fā)酵組中的乳酸菌總數分別在發(fā)酵6、4、6 d達到最大值，分別為9.94、9.83和9.84 lg cfu/g。之后各發(fā)酵組中乳酸菌總數下降。同時應用RT-PCR技術對單一菌種及復合菌種發(fā)酵組中L.casei Zhang，L.plantarum P8活菌數進行測定，結果顯示，L.casei Zhang、L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組在發(fā)酵3 d時達到最大值，分別為9.14和9.18 lg cfu/g，復合菌種發(fā)酵組中的L.casei Zhang、L.plantarum P8分別在發(fā)酵4和2 d時活菌數最高，為8.17和9.31 lg cfu/g。后續(xù)發(fā)酵過程中，L.casei Zhang、L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組和復合菌種發(fā)酵組中的L.plantarum P8活菌數變化不明顯，發(fā)酵10 d時活菌數分別是8.91、8.89和8.69 lg cfu/g。復合菌種發(fā)酵組中的L.casei Zhang在貯藏期間持續(xù)降低，發(fā)酵10 d時為6.58 lg cfu/g。其中L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組和復合菌種發(fā)酵組中的L.plantarum P8活菌數差異不顯著(P＞0.05)。

表3 各組在發(fā)酵期間乳酸菌活菌數的變化Table 3 Changes of Lactobacillus counts in all groups during fermentation

2.2.2 酵母菌的數量變化益生乳酸菌發(fā)酵的全價飼料中酵母菌活菌數逐漸減少，在發(fā)酵10 d時最低，L.casei Zhang、L.plantarum P8單一菌種及復合菌種發(fā)酵組中的酵母菌活菌數分別是3.74、3.65和3.72 lg cfu/g，顯著低于對照組(P＜0.05)。

2.2.3 霉菌的數量變化發(fā)酵結束時，益生乳酸菌發(fā)酵飼料中霉菌未被檢出。發(fā)酵4 d時，沒有檢測到L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組及復合菌種發(fā)酵組中的霉菌，此時L.casei Zhang單一菌種發(fā)酵組和對照組中霉菌活菌數分別為3.84和4.89 lg cfu/g。發(fā)酵6 d時，沒有檢測到L.casei Zhang單一菌種發(fā)酵組中的霉菌，對照組中霉菌在發(fā)酵6和10 d時的活菌數分別為5.01和4.77 lg cfu/g。

圖4 各組在發(fā)酵期間酵母菌活菌數的變化Fig.4 Changes of yeasts counts in all groups during fermentation

圖5 各組在發(fā)酵期間霉菌活菌數的變化Fig.5 Change of Mold counts in all groups during fermentation

2.2.4 大腸菌群的數量變化全價飼料發(fā)酵過程中的大腸菌群的活菌數變化見圖7。相比對照組，益生乳酸菌發(fā)酵飼料中的大腸菌群活菌數下降趨勢顯著(P＜0.05)，發(fā)酵10 d時，益生乳酸菌發(fā)酵的全價飼料中的大腸菌群未被檢出，此時對照組中的大腸菌群活菌數處于較高的水平，為7.82 lg cfu/g。

圖6 各組在發(fā)酵期間大腸菌群活菌數的變化Fig.6 Changes of Coliform bacteria counts in all groups during fermentation

2.2.5 芽胞桿菌的數量變化益生乳酸菌發(fā)酵飼料中的芽胞桿菌活菌數在飼料中呈現先升后降的趨勢，L.casei Zhang、L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組及復合菌種發(fā)酵組中芽胞桿菌活菌數分別在發(fā)酵2.5、1.5和1 d時出現最大值，為6.47、5.78和5.64 lg cfu/g，之后持續(xù)下降。發(fā)酵10 d時，L.casei Zhang、L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組及復合菌種發(fā)酵組的芽胞桿菌活菌數分別是2.71、2.69和2.41 lg cfu/g，顯著低于對照組(P＜0.05)。

圖7 各組在發(fā)酵期間芽胞桿菌活菌數的變化Fig.7 Changes of Bacilli bacteria counts in all groups during fermentation

2.2.6 梭狀芽胞桿菌的數量變化各發(fā)酵組在發(fā)酵期間梭狀芽胞桿菌活菌數在1.30～3.30 lg cfu/g范圍內波動變化，發(fā)酵組中梭狀芽胞桿菌活菌數顯著低于對照組(P＜0.05)。發(fā)酵10 d時，L.casei Zhang、L.plantarum P8單一菌種發(fā)酵組中的梭狀芽胞桿菌未被檢出，復合菌種發(fā)酵組和對照組中梭狀芽胞桿菌活菌數分別為1.47和2.15 lg cfu/g。

圖8 各組在發(fā)酵期間梭狀芽胞桿菌活菌數的變化Fig.8 Changes of Clostridum counts in all groups during fermentation

3 討論

3.1 添加L.casei Zhang和L.plantarum P8對全價飼料pH的影響

在全價飼料中添加L.casei Zhang和L.plantarum P8能夠明顯降低飼料的pH。其中L.casei Zhang單一菌種發(fā)酵全價飼料在發(fā)酵0～2 d時pH降低緩慢，這是由于L.casei Zhang蛋白水解能力較弱，菌株生長速度緩慢導致的。試驗結束時復合菌種發(fā)酵全價飼料pH低于單一菌種發(fā)酵飼料，說明L.casei Zhang與L.plantarum P8復合發(fā)酵彼此有較好的促進作用。

3.2 添加L.casei Zhang和L.plantarum P8對全價飼料微生物類群的影響

飼料中的雜菌對飼料的發(fā)酵品質有較大的影響，其中飼料中的酵母菌某些種能引起飼料變質，少數種屬于病原菌，其強烈的活動會帶來很嚴重的后果;霉菌是導致飼料好氣性變質的微生物之一，同時還分解飼料中的糖分及乳酸;大腸菌群可使飼料異常發(fā)酵導致飼料變質;芽胞桿菌分解飼料中的蛋白和脂肪，產生腐敗氣味，降低飼料的營養(yǎng)價值，影響飼料品質;梭狀芽胞桿菌為嚴格厭氧菌，如果控制不當，將產生外毒素，致動物發(fā)病。

添加益生乳酸菌對全價飼料中的酵母菌、大腸菌群、霉菌、芽胞桿菌和梭狀芽胞桿菌有良好的抑制效果。發(fā)酵初期，添加的益生乳酸菌和飼料中微生物的開始大量增殖，消耗了飼料環(huán)境中的少量氧氣，使飼料中的厭氧程度逐漸增強，促進了乳酸菌的生長，對其中的好氧細菌有抑制作用。同時發(fā)酵組中的乳酸菌在發(fā)酵2.5 d左右達到9.00 lg cfu/g以上，在飼料中形成絕對的優(yōu)勢，乳酸菌的代謝過程中產生大量的酸性物質，使發(fā)酵組在發(fā)酵3 d左右pH達到5.0以下，有效地抑制了飼料中不耐酸的雜菌如梭狀芽胞桿菌、霉菌、大腸菌群的生長，并且由于乳酸菌的優(yōu)勢菌群地位，與酵母菌爭奪飼料中糖分的過程中［21］，抑制酵母菌的增殖。益生乳酸菌在代謝過程中產生的一些抑菌物質(如乳酸、過氧化氫、乙醛等)，較好地抑制甚至殺滅了飼料中的雜菌。Elferink等［22］研究證實了這一點。蔡義民［23］的研究證實，在飼料中添加乳酸菌能夠有效地抑制霉菌、酵母菌和一般細菌的繁殖。L.casei Zhang單一菌種發(fā)酵組中雜菌活菌數高于另外2個發(fā)酵組，這可能是由于L.casei Zhang單菌發(fā)酵蛋白水解能力較弱，發(fā)酵初期菌株生長緩慢導致的［24］。對照組對飼料中酵母菌、大腸菌群、霉菌、芽胞桿菌和梭狀芽胞桿菌抑制作用不顯著，這可能是由于全價飼料中固有的乳酸菌產酸能力弱造成的［25］，pH的變化情況也較好地說明了這一點。

酵母菌菌體中含有非常豐富的蛋白質、B族維生素、脂肪、糖、酶等多種營養(yǎng)成分。大量的應用研究試驗證明，酵母在提高動物免疫力、提高動物生產性能和減少應激等方面均起作用［26-27］。所以，在評價發(fā)酵飼料的質量時，不能簡單地認為酵母菌越少越好。

總之，在全價飼料中接種的L.casei Zhang和L.plantarum P8能夠快速增殖并達到一定的數量，其發(fā)酵過程中產生大量酸性物質，快速降低了飼料的pH，從而有效抑制飼料中雜菌的增殖，保證飼料的質量。在接種的益生乳酸菌活菌數達到最大值后，繼續(xù)發(fā)酵過程中單一菌種發(fā)酵和復合菌種發(fā)酵的全價飼料中的益生乳酸菌呈現了較好的穩(wěn)定性，這對飼料的長時間保藏是非常有利的。

本文采用益生菌L.casei Zhang和L.plantarum P8單一菌種及復合菌種發(fā)酵全價飼料，通過對發(fā)酵過程中全價飼料的pH及微生物類群的變化，研究2株益生菌在發(fā)酵全價飼料中的應用。添加了益生乳酸菌的全價飼料，其pH降低較快，能夠很好地抑制全價飼料中其他雜菌甚至有害菌的增長，長時間發(fā)酵過程中具有良好的穩(wěn)定性，保證全價飼料具有良好的品質。研究表明，L.casei Zhang和L.plantarum P8具有發(fā)酵優(yōu)質全價飼料的潛力。

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