1株產(chǎn)纖維素酶木霉菌種的鑒定

桓明輝，李楊，劉曉輝，鄧春海，高曉梅，敖靜，王平

(1.遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽(yáng)122000;2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110036)

纖維素是綠色植物細(xì)胞壁的主要成分，是地球上最豐富的有機(jī)物質(zhì)，也是一類取之不盡，用之不竭的可再生能源。每年由于工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可產(chǎn)生大量的纖維素廢棄物，如農(nóng)作物秸稈、鋸木渣、植物農(nóng)藥殘?jiān)蜕罾?。如何有效利用這些廢棄物，對(duì)解決環(huán)境污染及實(shí)現(xiàn)生物資源可持續(xù)性發(fā)展具有重大意義。目前，纖維素廢棄物主要是通過(guò)物理、化學(xué)、生物或者三者聯(lián)合的處理方法，使這些物質(zhì)可以用于生產(chǎn)燃料、有機(jī)肥、飼料添加物和化工原料等。因而纖維素作為一種可再生能源，它的開(kāi)發(fā)和利用越來(lái)越受到人們的廣泛關(guān)注。木霉菌具有較強(qiáng)的分解纖維素能力，通過(guò)分泌胞外氧化酶來(lái)降解木素，這種木素降解酶系的主要成分有纖維素酶、半纖維素酶和β-葡萄糖苷酶等。由于它在降解木素、微生物菌體形態(tài)形成以及植物病原等方面的功用，使之在制漿造紙工業(yè)、染發(fā)工藝、飲料加工工藝等方面得到了重要的研究和應(yīng)用。尤其在制漿造紙工業(yè)的紙漿生物漂白、廢水處理等方面具有很大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力。本文主要通過(guò)形態(tài)及分子手段對(duì)本實(shí)驗(yàn)室自行篩選的1株木霉菌種F-01-6進(jìn)行分類鑒定，為對(duì)該菌的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株本實(shí)驗(yàn)室自行篩選的木霉菌種F-01-6。

1.1.2 培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基:土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂16 g，加水至1 L;MEA培養(yǎng)基:麥芽糖12.5 g，瓊脂16 g，加水至1 L。

1.2 方法

1.2.1 菌株形態(tài)觀察將保存菌株接種到PDA培養(yǎng)基平皿上，置于28℃培養(yǎng)72 h，觀察并記錄菌落特征和菌株形態(tài)特征。

1.2.2 菌絲培養(yǎng)及基因組DNA的提取將低溫保藏的木霉菌菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，25℃下培養(yǎng)。7 d后接入100 mL PDA液體培養(yǎng)基中，28℃下100 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，收集菌絲，TE緩沖液洗滌后放入-20℃冰箱保藏備用。用本實(shí)驗(yàn)室提取鏈霉菌基因組DNA的方法略加改動(dòng)，DNA提取物于-4℃冰箱貯藏備用。

1.2.3 基因間隔序列(ITS)基因PCR擴(kuò)增引物:試驗(yàn)采用引物為通用引物，由大連寶生物合成。具體序列為ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR反應(yīng)體系(25 μL):10×緩沖液2.5 μL，dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL，引物各1 μL，Taq酶(83.35 mol/L)0.50 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 18.25 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃變性5 min;95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán):72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 PCR產(chǎn)物回收及測(cè)序采用低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳切膠回收產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物回收后，以PCR引物為測(cè)序引物，分別從正反鏈雙向測(cè)序，由大連寶生物公司完成。

1.2.5 序列分析測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行比對(duì)。將測(cè)得的序列與用Blast軟件從GenBank搜索到的相關(guān)序列，用CLUSTAL X［4-5］軟件進(jìn)行對(duì)位排列后再進(jìn)行手工校正。構(gòu)建ITS系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析采用軟件MEGA4中的鄰近相鄰法進(jìn)行，利用bootstrap(1 000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的置信度。序列間進(jìn)化距離根據(jù)Kimura-2參數(shù)遺傳距離模型用分子進(jìn)化遺傳分析軟件(MEGA)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)特征及顯微觀察

菌落在MEA培養(yǎng)基表面蔓延迅速，初期無(wú)色至淺黃色，后綠色;分生孢子梗分枝與綠色木霉形態(tài)相似，但其孢子壁光滑。瓶梗單生、對(duì)生或3～5個(gè)輪生，7.3～12 μm×2.5～3.3 μm;分生孢子壁光滑，短圓柱形，形狀規(guī)則，基部平截，3.0～5.6 μm×2.0～3.4 μm(圖1)。

圖1 F-01-6形態(tài)圖片F(xiàn)ig.1 F-01-6 Merphological picture

2.2 菌株的分子鑒定

2.2.1 菌株的rDNA ITS區(qū)PCR擴(kuò)增及測(cè)序2菌株的rDNA ITS區(qū)(含5.8 S區(qū))PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果顯示的條帶特異、效果好。采用低熔點(diǎn)瓊脂糖法進(jìn)行切膠純化回收并測(cè)序。菌株F-01-6 rDNA ITS區(qū)段總長(zhǎng)度為556 bp。

2.2.2 序列分析結(jié)果將所測(cè)菌株的ITS區(qū)序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast搜索，得到同源性較高的同屬不同種的ITS序列(表1)，在Blast搜索的結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)200個(gè)菌種與F-01-6同源性都為99%，其中有4株菌與其同源性為100%。下載GenBank中同源性較高菌株的ITS序列與本實(shí)驗(yàn)所測(cè)的菌株ITS序列共同進(jìn)行了比對(duì)，利用C1ustal X軟件將序列匹配排列后，利用MEGA4.1軟件采用鄰近相鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree

在Blast結(jié)果中可以看出，本菌株(SYS4993)的ITS區(qū)序列與Trichoderma longibrachiatum(長(zhǎng)梗木霉)、Hypocrea pseudokoningii(擬康寧木霉)、Trichoderma koningii(康寧木霉)等的ITS區(qū)序列同源性均為99%。序列相似性大于95%且小于99%，鑒別為相同屬;序列相似性小于95%，鑒別為同科。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中可以看出，需要鑒定的菌株F-01-6(SYS4993)與EU935218(Trichoderma koningii)的置信度為92，遺傳距離最近，結(jié)合菌體的形態(tài)學(xué)特征及子實(shí)體形態(tài)可以確定F-01-6為Trichoderma koningii。

表1 從GenBank中下載的同源性較高菌株Table 1 Higher homologous strains DownLoaded from GenBank

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，確定此株產(chǎn)纖維素酶的木霉為Trichoderma koningii。

傳統(tǒng)的真菌分類主要是根據(jù)子實(shí)體外觀形態(tài)或微觀的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，但表型特征受環(huán)境影響較大，這就使得在不同環(huán)境條件下生長(zhǎng)的同一種真菌經(jīng)常表現(xiàn)出較大的形態(tài)差異，給分類和鑒定帶來(lái)困難，真核生物編碼核糖體核酸的基因是一個(gè)串聯(lián)的重復(fù)轉(zhuǎn)錄單位，即18S rRNA-ITSI-5.8S rRNA-ITSII-28S rRNA，約100～200拷貝，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)，分隔編碼區(qū)18、5.8、28S rDNA亞單位ITS為非編碼區(qū)，編碼區(qū)序列相對(duì)保守，而核糖體rDNA ITS序列變異較快?？商峁┹^豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)。因此可作為一種分子標(biāo)記用于屬和種水平上的系統(tǒng)進(jìn)化分析。近年來(lái)，這方面的文章很多，如利用ITS序列研究冬蟲(chóng)夏草和香菇的系統(tǒng)發(fā)育。由于ITS序列具有方便、快速的特點(diǎn)，因此也用于鑒定一些未知植株，如利用ITS序列對(duì)松茸和松乳菇的組織分離物進(jìn)行的鑒定，所以rDNA ITS序列具有菌種分類鑒定的意義。

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