廣西傳統(tǒng)發(fā)酵米粉中乳酸菌的分離鑒定

史國英，余功明，胡春錦*

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西南寧530007;2.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530007;3.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧530005)

在眾多的大米加工食品中，米粉作為一種傳統(tǒng)主食具有獨(dú)特的優(yōu)勢，在我國南方及東南亞地區(qū)有廣闊的市場。據(jù)相關(guān)資料報(bào)道，廣西的米粉生產(chǎn)和消費(fèi)量巨大，目前共有米粉生產(chǎn)廠三百多家，制售米粉的飲食店、米粉零售代銷點(diǎn)五千多家，每天銷售米粉約400萬kg［1］。發(fā)酵米粉是我國南方傳統(tǒng)米粉的一種特殊生產(chǎn)方法，即將大米于自然條件發(fā)酵后再以常規(guī)榨粉方法生產(chǎn)米粉。經(jīng)過自然發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵米粉，口感爽滑，有筋道感，品質(zhì)優(yōu)于不發(fā)酵米粉，深受消費(fèi)者的喜愛。但是，由于我國目前對本土的傳統(tǒng)食品開發(fā)不夠，米粉加工技術(shù)普遍比較落后，發(fā)酵米粉的生產(chǎn)基本上是手工作坊式的，生產(chǎn)規(guī)模小，對傳統(tǒng)工藝的實(shí)質(zhì)不清楚，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定［2］。因此，對發(fā)酵米粉進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化、規(guī)范化的生產(chǎn)是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。而要達(dá)到這一目標(biāo)必需對米粉自然發(fā)酵過程的相關(guān)機(jī)制有深入的了解，其中弄清楚在發(fā)酵過程中起作用的微生物以及這些微生物的特性是基礎(chǔ)和前提。廣西作為米粉生產(chǎn)和消費(fèi)量巨大的省區(qū)，對傳統(tǒng)發(fā)酵米粉發(fā)酵過程中相關(guān)微生物的研究卻鮮有報(bào)道。據(jù)報(bào)道［3］，米粉發(fā)酵以厭氧發(fā)酵為主，乳酸菌是發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢菌群。本文對廣西傳統(tǒng)發(fā)酵米粉發(fā)酵過程中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，擬為弄清廣西傳統(tǒng)發(fā)酵米粉中有益微生物資源及其利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品乳酸菌分離樣品于2010年11月采自南寧市郊手工作坊式發(fā)酵米粉廠，用無菌玻璃杯從米粉發(fā)酵池中取發(fā)酵不同時(shí)間的發(fā)酵液500 mL，利用選擇性培養(yǎng)基分離乳酸菌。

1.1.2 培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸粉5 g，檸檬酸氫二銨2 g，葡萄糖20 g，土溫-80 1 mL，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂10 g，水1 L，pH 6.5;LB固體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉10 g，水1 L，pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離①稀釋液的制備:量取米粉發(fā)酵液5 mL移入帶玻璃珠的45 mL無菌水中，以漩渦振蕩器充分振蕩3 min后，吸取1 mL注入9 mL無菌水。重復(fù)以上操作，依次用無菌水10倍系列稀釋至10-6，取10-4～10-6樣品稀釋液用于微生物分離培養(yǎng);②平板接種與分離培養(yǎng):取20 μL適宜稀釋度的稀釋液涂布于含碳酸鈣(3 g/L)的MRS瓊脂培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋度做4個(gè)重復(fù)。分別于30和37℃培養(yǎng)48 h，觀察優(yōu)勢乳酸桿菌典型的菌落特征。挑取CaCO3溶解圈較大的單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，以平板劃線法轉(zhuǎn)接5次后獲得純培養(yǎng)菌株，以試管斜面培養(yǎng)于4℃冰箱保藏。

1.2.2 菌株的常規(guī)鑒定參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［4］，通過培養(yǎng)性狀、革蘭染色、菌體形態(tài)觀察、過氧化氫酶試驗(yàn)等對分離獲得的乳酸菌進(jìn)行初步鑒定。

1.2.3 菌株的分子鑒定①細(xì)菌基因組DNA的制備:菌株活化以后以LB培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d，收集菌體用于DNA提取。利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供)，按產(chǎn)品說明書提取各菌株的基因組DNA，保存于-20℃?zhèn)溆?②16S rDNA片段擴(kuò)增及測序:細(xì)菌16S通用引物Primer 1(F27):(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')和Primer2(R1492)(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積50 μL，分別為DNA模板2.5 μL，引物(10 μmol/L)各1.5 μL，dNTP mixture 25.0 μL，ddH2O 19.5 μL。反應(yīng)程序:94℃3 min預(yù)變性，然后進(jìn)行94℃1 min，52℃1 min，72℃1.3 min，32個(gè)循環(huán)，最后72℃10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序;③菌株同源性比對:菌株的16S rDNA測序結(jié)果在GenBank上登錄，進(jìn)行同源性序列搜索，利用http://blast.ncbi.nlm.nih.gov的BLAST程序進(jìn)行同源性比較，并用軟件MEGA version 4.0［5］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)一步確定其分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離結(jié)果

MRS培養(yǎng)基中加入CaCO3，有利于顯示乳酸菌產(chǎn)生的高酸，乳酸可將培養(yǎng)基中的CaCO3溶解，在菌落周圍產(chǎn)生典型的透明圈，通過形成的透明圈識別乳酸菌。本研究從米粉發(fā)酵液中分離篩選獲得可產(chǎn)生透明圈的乳酸菌，通過多次純化得到6株純培養(yǎng)菌株，菌株編號依次為S1～S6。

2.2 菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征菌株在LB固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)2 d，S3、S4菌落大小2～3 mm，表面粗糙如雪花狀，邊緣不規(guī)則，無光澤，扁平，灰白色，在10×100倍顯微觀察下其形態(tài)為多樣，粗長桿、細(xì)長桿、彎曲桿、短桿和棒狀桿等，菌體呈長短不一的鏈桿狀排列，無芽胞，為革蘭陽性，過氧化氫酶陰性;S1、S2、S5、S6菌落大小1～2 mm，表面光滑，邊緣整齊，呈圓形，無光澤，凸起，灰白色，半透明，在10×100倍顯微觀察下其形態(tài)大小均一，呈球形或卵圓形，一般成對或鏈狀排列，無芽胞，為革蘭陽性，過氧化氫酶陰性。

2.2.2 16SrDNA基因分析利用引物F27、R1492對6株乳酸菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到16S rDNA基因序列，擴(kuò)增結(jié)果為大小約1 500 bp的單一片段。擴(kuò)增片段的測序結(jié)果在GenBank上登錄，并在核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性序列搜索，結(jié)果見表1。結(jié)果表明本研究獲得的4株乳酸菌與Pediococcus pentosaceus具有較高的同源性，2株乳酸菌與Lactobacillus plantarum的親緣關(guān)系最近，可以判斷為同種。

選取典型菌株S1和S4分別構(gòu)建2種乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹。用軟件MEGA version 4.0將菌株S1與來自GenBank的17株細(xì)菌一起構(gòu)建基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。該系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，菌株S1與戊糖片球菌Pediococcu sp.在100%bootstrap水平上相聚一群(圖1)，而與戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus的親緣關(guān)系最近，表明該菌株S1與戊糖片球菌具有最高的遺傳相似性。S4菌株則與植物乳桿菌Lactobacillus plantarum的親緣關(guān)系最近(圖2)。

表1 6株乳酸菌的16SrDNA序列分析結(jié)果Table 1 16SrDNA sequences analysis of the six Lacti Acid Bacteria strains'

3 討論

微生物的分子生物學(xué)鑒定方法解決了傳統(tǒng)方法難以確定的許多菌種的分類問題，具有操作簡便、結(jié)果客觀、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)［6］。雖然經(jīng)典分類學(xué)研究實(shí)驗(yàn)條件的要求不高，但方法復(fù)雜，試驗(yàn)工作量大，而且結(jié)果也可能不夠精確［7］。本文結(jié)合傳統(tǒng)分類學(xué)和分子生物學(xué)的方法對發(fā)酵米粉中的主要乳酸菌進(jìn)行分類鑒定，綜合分析所得出的鑒定結(jié)果是可靠的。

由于多數(shù)乳酸菌對人體健康的有益特性及其在國民經(jīng)濟(jì)中的重要作用，近年來，利用乳酸菌發(fā)酵食品、藥品、飼料等層出不窮［8］。乳酸菌是發(fā)酵米粉中起主要作用的優(yōu)勢菌群，其種類和數(shù)量對米粉發(fā)酵的時(shí)間和品種有較大的影響，自然發(fā)酵使米粉的口感得到一定程度的改善，具體表現(xiàn)為米粉彈性和筋道感增加［3］。本研究首次對廣西傳統(tǒng)發(fā)酵米粉的乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定，獲得的菌株主要為Pediococcus pentosaceus和Lactobacillus plantarum 2種乳酸菌，其中P.pentosaceus為主要優(yōu)勢菌株，和魯戰(zhàn)會(huì)等［9］報(bào)道的湖南常德發(fā)酵米粉中乳酸菌的優(yōu)勢菌株主要為L.plantarum有一定差異;本研究從南寧當(dāng)?shù)孛追蹣悠分蟹蛛x獲得的乳酸菌均為對人體有益的菌株，未發(fā)現(xiàn)有潛在致病性的菌株?？梢?，我國傳統(tǒng)發(fā)酵米粉中存在著優(yōu)良的自然乳酸菌菌株，而不同地區(qū)的起主要發(fā)酵作用的菌株存在一定差異，因此，在利用人工模擬自然發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵米粉的規(guī)?；a(chǎn)中，應(yīng)首先考慮發(fā)掘和利用當(dāng)?shù)匕l(fā)酵米粉中優(yōu)勢乳酸菌資源。

米粉生產(chǎn)基本上對大米進(jìn)行了徹底利用，原料用量大，利用率高，不會(huì)造成資源浪費(fèi);傳統(tǒng)發(fā)酵米粉由于其獨(dú)特的風(fēng)味，深得廣大消費(fèi)者的喜愛，近年來米粉還逐步實(shí)現(xiàn)了向我國北方市場的擴(kuò)展，具有廣闊的前景［10］。傳統(tǒng)優(yōu)勢食品的整理開發(fā)是一個(gè)綜合性的研究課題，自然發(fā)酵也是一個(gè)復(fù)雜性的過程，獲得發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群只是一個(gè)起步，深入研究其代謝機(jī)制并明確其最佳發(fā)酵條件以及微生物發(fā)酵與米粉的特殊口感的相關(guān)性還有待進(jìn)一步的研究。

［1］ 楊玉英，洪群聯(lián)，薄鎧奇.我國食品公共安全保障體系的情況與建議—廣西食品安全保障體系的調(diào)查與思考［J］.經(jīng)濟(jì)研究參考，2011，(45):13-21.

［2］ 魯戰(zhàn)會(huì).生物發(fā)酵米粉的淀粉改性及凝膠機(jī)理研究［D］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2002.

［3］ 周顯青，李亞軍，張玉榮.不同微生物發(fā)酵對大米理化特性及米粉食味品質(zhì)的影響［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，31(1):4-8，13.

［4］ 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京:科學(xué)出版社，2001.

［5］ Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA4:Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2007，24(8):1596-1599.

［6］ 周賢軒，楊波，陳新華.幾種分子生物學(xué)方法在菌種鑒定中的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)，2004，14(6):35-38.

［7］ 褚學(xué)英，惠豐立，李曉輝.大曲中主要酵母菌的分子鑒定［J］.中國釀造，2008，(5):27-29.

［8］ 張慧杰，玉柱，王林，等.青貯飼料中乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)良菌株篩選［J］.草地學(xué)報(bào)，2011，19(1):137-141.

［9］ 魯戰(zhàn)會(huì)，彭荷花，李里特，等.常德發(fā)酵米粉中的微生物分離純化與鑒定［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2006，21(3):23-26.

［10］ 黃長廣，曾慶孝，朱浩權(quán).廣東米粉的發(fā)展［J］.糧油食品科技，2000，8(2):1-2.