石油降解菌株的分離鑒定及降油特性

雒曉芳，楊琴，陳麗華，3，周立輝，徐紅偉

(1.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，甘肅蘭州730124;2.長(zhǎng)慶油田公司油氣工藝研究院，陜西西安710018;3.蘭州大學(xué)西部環(huán)境與氣候變化研究院，甘肅蘭州730000)

土壤中微生物資源豐富，自然條件下大多數(shù)微生物代謝不活躍。當(dāng)這些微生物遇到適當(dāng)?shù)拇碳?氧、營(yíng)養(yǎng)等)時(shí)復(fù)蘇開始其代謝(降解)過程。對(duì)微生物進(jìn)行篩選和分離可以選出降解能力較強(qiáng)的微生物即優(yōu)勢(shì)菌，在土壤中添加這些優(yōu)勢(shì)菌，可以在一定程度上提高微生物對(duì)污染物的降解作用。在長(zhǎng)期被石油污染的土壤和活性污泥中微生物可逐步改變自身的代謝條件以適應(yīng)環(huán)境條件，即以石油烴為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)將石油烴降解，因此在這種土壤中存在著可降解石油烴的微生物，石油烴降解菌的分離是生物法處理石油污染的關(guān)鍵。在自然界凈化石油烴類污染的綜合因素中微生物降解起著重要的作用，目前已報(bào)道有多個(gè)種屬具有分解和轉(zhuǎn)化石油組分的能力［1］。近年來，石油烴的生物降解受到了人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注，在石油污染的生物處理中，石油降解菌利用碳源而將其降解［2-4］。石油降解微生物的資源研究已經(jīng)成為一個(gè)重要方向，國(guó)際上已建成專門的降解微生物菌種資源庫(kù)［5］。目前已分離鑒定的烷烴降解菌有假單胞菌(Pseudomonas)［6］、腸桿菌(Enterobacter)、不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)、棒桿菌(Nocardia)和諾卡氏菌(Corynebacterium)等［7］。由于石油污染物具有組成復(fù)雜性、生物難降解性和較低的生物可利用度等特點(diǎn)，土著微生物難以有效、快速、徹底地降解土壤中的石油烴［8］。同時(shí)，石油的主要成分是烷烴類物質(zhì)，水溶性較低，較難被微生物利用，因此對(duì)烷烴降解菌的篩選分離是生物法處理石油污染物的關(guān)鍵。在長(zhǎng)期被石油污染的土壤中，微生物可逐步改變自身的條件適應(yīng)環(huán)境，進(jìn)行選擇性富集并發(fā)生遺傳變異，因此在這種土壤中存在著可降解烷烴的微生物［9］。然而，污染土壤的石油組分復(fù)雜，大致分為烷烴(占65%～70%)、芳香烴(占10%～15%)和樹脂與瀝青質(zhì)(占8%～10%)3大類，各組分的生物可降解程度不同，降解過程復(fù)雜，其中芳香烴類最難被降解。單一的細(xì)菌或真菌因產(chǎn)生酶的種類比較少且濃度較低，所以一般只能降解少數(shù)特定烴類或只降解到某一階段，復(fù)雜烴類的徹底降解往往需要多種微生物協(xié)同聯(lián)合作用［10］。所以，篩選高效降解石油的微生物菌種是生物修復(fù)的必然，目前有關(guān)石油降解菌方面的研究報(bào)道較多［11-12］，但尚未見到白色類諾卡氏菌(Nocardioides albus)降解石油方面的研究。因此，本課題組從甘肅華慶油田油井附近地表深度10 cm左右石油污染土壤中采樣，通過多次富集并篩選分離出1株高效石油降解菌株，利用生理生化測(cè)試和16S rDNA序列分析進(jìn)行分子鑒定，初步探討了其降解特性，以期為微生物在石油污染土壤治理中的應(yīng)用提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)土樣石油污染土樣取自甘肅華慶油田油井附近地表深度為10 cm左右石油污染土壤，裝入無菌袋中密閉保存于4℃冰箱。

1.1.2 培養(yǎng)基無機(jī)鹽培養(yǎng)基:NH4NO32 g/L，K2HPO41.5 g/L，KH2PO43 g/L，微量元素液2 mL，蒸餾水1 000 mL;微量元素液(g/L):MgSO4·7H2O 0.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2，CuSO40.1，無水CaCl20.01，Na2EDTA·2H2O 0.01;降油培養(yǎng)基:無機(jī)鹽培養(yǎng)基1 000 mL，原油6 g，若配制固體培養(yǎng)基需另加瓊脂20 g。保存培養(yǎng)基為牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

1.2 方法

1.2.1 F1菌株的分離土樣2.5 g，添加到裝有200 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，在30℃，120 r/min的恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)7 d，移取一定量的富集培養(yǎng)液接入新鮮降油培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)7 d，共重復(fù)3次，經(jīng)過3個(gè)周期的馴化后，在無菌的條件下，用接種環(huán)蘸取馴化培養(yǎng)液，在降油培養(yǎng)基的平板上劃線后，平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72 h，然后將代表性較好的菌落在降油培養(yǎng)基平板上反復(fù)劃線純化得到單一菌落，再將純化的菌株接種至斜面保存培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，保存于4℃冰箱中，待用。

1.2.2 菌株的鑒定①生理生化鑒定:參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［13］，對(duì)菌株進(jìn)行明膠液化、牛奶凝固與胨化、淀粉水解、纖維素分解、硝酸鹽還原反應(yīng)、硫化氫的產(chǎn)生、碳源的利用、黑色素的產(chǎn)生等生理生化指標(biāo)的檢測(cè)觀察。按文獻(xiàn)［14］方法進(jìn)行碳、氮源利用試驗(yàn);②分子鑒定:采用細(xì)菌16S rRNA PCR通用引物，2個(gè)PCR引物分別為8F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1512R(5'-ACGGCTACCTTGTCGACTT-3')，對(duì)應(yīng)于大腸埃希菌16S rRNA基因的第8～27個(gè)堿基和第1 512～1 495個(gè)堿基。引物由寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)合成。以細(xì)菌總DNA為模板，PCR反應(yīng)條件:94℃5 min，1 cycle;94℃1 min、55℃1 min、72℃1.5 min，30 cycles;72℃5 min 1 cycle。把16S rDNA PCR產(chǎn)物與PMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)12 h后進(jìn)行測(cè)序。將16S rDNA測(cè)序結(jié)果用Blast軟件與GenBank中15株參考菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比較分析。用分子進(jìn)化遺傳學(xué)分析與序列比對(duì)軟件MEGA5.1的鄰近相接法(Neighbor-JoiningMethod)對(duì)clustalx多重比對(duì)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，采用Boot strap方法對(duì)500個(gè)重復(fù)進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)［15］，確定F1菌株的分類地位。

1.2.3 紫外分光光度法測(cè)定石油烴含量配置含油量分別為0、0.2、0.4、0.8、2.0、4.0、5.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)油樣，以石油醚(脫芳烴)為對(duì)照，在紫外分光光度計(jì)224 nm處測(cè)出不同濃度樣品的吸光度，得原油的標(biāo)準(zhǔn)曲線。土樣取自甘肅華慶油田油井污染土壤，經(jīng)碎散、除雜、過篩(1.25 mm)、混均后將土壤樣品分別裝入6個(gè)體積為22 cm×6 cm×22 cm的玻璃缸。采用三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)法制備F1菌液，將其濃度達(dá)到1×1010cfu/mL后放置4℃冰箱備用。每缸裝土1 kg，每一缸為1組，分為3組。1#:1 kg污染土壤，加1 mL F1菌液，并添加3 g標(biāo)準(zhǔn)油樣，攪勻;2#:1 kg污染土壤，加1 mL F1菌液，并添加5 g標(biāo)準(zhǔn)油樣，攪勻;3#:1 kg污染土壤，加1 mL F1菌液，并添加10 g標(biāo)準(zhǔn)油樣，攪勻。考慮到微生物有一定的存活時(shí)間，故擬定本實(shí)驗(yàn)歷時(shí)42 d，加無菌水保持土壤含水率每天在20%左右，在第0、3、7、10、17、24、31、38、42天時(shí)采用5點(diǎn)法分別從3個(gè)缸中取土樣20 g，放入3個(gè)索氏提取器中，用150 mL沸程為60～90℃的石油醚索氏提取12 h，回流溫度為60～65℃，虹吸速度為3～5次/分，回流72 h后測(cè)得索氏提取率為90.55%，將提取液移入250 mL的容量瓶中，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定3個(gè)缸中污染物含量在224 nm下的吸光度，根據(jù)原油標(biāo)準(zhǔn)曲線求得石油烴污染物的含量。

1.2.4 GS-MC測(cè)定原油各組分將F1菌株接入20 mL含10 mg原油的無機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角燒瓶，28℃搖床震蕩培養(yǎng)7 d，取出加入氯仿10 mL，放入超聲波儀器中破乳15 min，倒入滴液漏斗中萃取出氯仿相，如此反復(fù)3次，將萃取液收集一起，放入水浴中將氯仿蒸發(fā)殆盡，剩下的殘油準(zhǔn)確稱量后定容10 mL，即為GS-MC測(cè)試降解油樣。同樣方法，同時(shí)不添加F1菌劑設(shè)置對(duì)照組。降解油樣各組分分析條件:氣化溫度260;載氣He;柱溫200;柱SE-30(50 m);質(zhì)譜條件:電子能量70 eV，質(zhì)量范圍40～450。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的原油對(duì)F1菌株的降油影響

測(cè)得原油的標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.019 6x①，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 3(圖1)。為方便計(jì)算，將其轉(zhuǎn)變?yōu)?50 mL樣品中所含的石油類總量和吸光度之間的關(guān)系式:M=12.755 1D②。其中，D為用250 mL石油醚萃取含油油樣得到萃取液的有效吸光度，無量綱;M為樣品所含污染物總量。

對(duì)1#、2#、3#土樣的殘留量進(jìn)行回歸方程的分析，可以看出石油殘留量曲線符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程［16］:lnρ(油)=lnρ(油)-kt(1)，式中:ρ(油)可為任意時(shí)刻石油殘留量。ρ(油)為第0天殘留量，k為降解速度常數(shù)，t為半衰期。利用k值可以指示不同濃度的微生物降解速度。由(1)式可得西-27原油的半衰期公式:t1/2=ln2/k(2)。由(2)式可以計(jì)算出F1菌株在含油濃度0.3%、0.5%、1.0%土樣中降解原油的半衰期分別為17.2、18.2、23.7 d。

圖1 原油的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of crude oil

由圖2可知，原油濃度為0.3%、0.5%、1.0%3組土樣的降解速度依次降低。用紫外分光光度計(jì)測(cè)得索氏提取液250 mL的Abs，根據(jù)M=12.755 1D計(jì)算得1 kg土樣在不同天數(shù)污染物殘留量，然后換算為降解率。1#、2#、3#土樣17 d降解率分別為40.23%、46.41%、42.07%，24 d達(dá)到72.02%、69.87%、56.57%，降解率均超過50%，42 d后均達(dá)到78%以上。

圖21 #、2#、3#土樣的石油烴隨時(shí)間的變化規(guī)律Fig.2 Curve of remaining TPH concentration in soil under different soil samples conditions

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 生理生化測(cè)試F1菌株革蘭陽(yáng)性;不抗酸;明膠液化;牛奶不凝固，但胨化;淀粉水解;纖維素上不生長(zhǎng);硝酸鹽不還原;利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-果糖、D-甘露醇;利用蔗糖，很少利用棉子糖;不利用肌醇;不產(chǎn)生類黑色素;產(chǎn)生H2S氣體。

2.2.2 分子鑒定將F1菌株16S rDNA全序列輸入GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與白色類諾卡氏菌(Nocardioides albus)之間的同源性達(dá)99.0%。選取近緣的菌株序列通過MEGA5.1的鄰近相接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，將其初步確定為白色類諾卡氏菌(Nocardioides albus)。

圖3 F1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the strain F1

2.3 F1菌株對(duì)原油不同組分的降解

所采原油為長(zhǎng)慶油田延長(zhǎng)組-三疊紀(jì)-湖相成油，從原油GC-MS圖譜分析可知，該地區(qū)原油正構(gòu)烷烴的碳數(shù)主峰靠前為nC15，高碳數(shù)正構(gòu)烷烴降解明顯，奇數(shù)碳優(yōu)勢(shì)已不夠明顯，霍烷和甾烷的異構(gòu)化現(xiàn)象明顯，均說明成烴環(huán)境微生物發(fā)育，原油演化程度高，成熟度高。非烴和多環(huán)芳烴在成烴環(huán)境中熱、壓力能量和微生物作用下，已多數(shù)演化為類異戊二烯烷烴等烴類物質(zhì)，在離子流圖中較難提取，含量很少。這種特征與黃廷林等［17］研究陜北油田(同一組系)原油組分特征測(cè)定結(jié)果一致。故以氯仿提取F1降解后原油做GC-MS分析，其組分亦主要包括飽和烴(正構(gòu)烷烴、霍烷、甾烷系列)，芳烴、非烴含量很少。以下對(duì)降解前后，主成分正構(gòu)烷烴、霍烷系列的各個(gè)物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定、含量及降解率分析見表1、2。2系列總離子流圖見圖4、5。

表1 7d后油樣中正構(gòu)烷烴組分及降解率分析Table 1 The n-alkanes components and degradation rate of oil samples

表2 7d后油樣中霍烷主組分及降解率分析Table 2 The hopane components and degradation rate of oil samples

圖4 降解前后正構(gòu)烷烴總離子流圖Fig.4 Degradation of n-alkanes before and after total ion chromatorgraphy

圖5 降解前后霍烷總離子流圖Fig.5 Degradation of hopanes before and after the total ion chromatorgraphy

由表1、2可見，等量原油經(jīng)F1降解前、后，正構(gòu)烷烴最大峰度從15×104下降至9×104，整體降低約40%，而且以C22為界，表現(xiàn)出明顯的后峰前移峰形，完全符合多數(shù)石油降解菌以原油為碳源的降解演化規(guī)律，即先降解高碳數(shù)正構(gòu)烷烴為低碳數(shù)正構(gòu)烷烴，在整體峰度下降中還表現(xiàn)出另一特征:高碳數(shù)正構(gòu)烷烴中奇數(shù)碳向偶數(shù)碳正構(gòu)烷烴演化規(guī)律。從表1數(shù)據(jù)可見，F(xiàn)1菌可以廣泛利用從C14～C39正構(gòu)烷烴為碳源，降解率在42.8%～89%，平均64%，另外，雖然原油已經(jīng)歷過成烴環(huán)境微生物和熱作用，奇數(shù)優(yōu)勢(shì)已不如成熟度低的原油，但仍可從表1看出奇數(shù)碳正構(gòu)烷烴降解率普遍高于偶數(shù)碳，表現(xiàn)出多數(shù)降解菌在利用長(zhǎng)鏈飽和烴時(shí)優(yōu)先降解奇數(shù)碳正構(gòu)烷烴的特征。

原始原油和經(jīng)歷細(xì)菌作用7 d的原油的藿烷系列碳數(shù)分布相同均為C27～C35(C28缺失)，主峰相同均為C30-αβ藿烷?；敉樽畲蠓宥葟?×104降至6.5×104，降低8%，有明顯高等植物母質(zhì)輸入，與生烴古環(huán)境一致。含量最高的17α(H)，21β(H)-藿烷降解率僅是0.84%，其次是17α(H)，21β(H)-30-降藿烷，降解率16.75%，平均降解10.23%。表明原油經(jīng)F1作用7 d后，烷烴受到較明顯的降解，五環(huán)三萜烷(藿烷)則比較穩(wěn)定。如表2所見，Ts為18α(H)-22、29、30-三降藿烷，Tm為17α(H)-22、29、30-三降藿烷，Ts/Tm是石油地質(zhì)領(lǐng)域常用的有機(jī)質(zhì)演化程度參數(shù)。Ts/Tm比值越大反映出有機(jī)質(zhì)受外作用力的程度越強(qiáng)，研究樣品主要改變的外作用力是F1菌作用，所以Ts/Tm比值越大則F1菌對(duì)原油的降解越強(qiáng)烈。雖然原油成熟度已較高，Ts含量達(dá)到3.512%，但經(jīng)F1作用，仍可以看到降解后的Tm向Ts轉(zhuǎn)化，Tm降解率8.22%，Ts降解率-4.85%，表明F1菌株能較好地促使五環(huán)三萜類化合物立體構(gòu)型中不穩(wěn)定構(gòu)型向穩(wěn)定性構(gòu)型轉(zhuǎn)化。

3 討論

F1菌株的形態(tài)特征和生理生化試驗(yàn)指標(biāo)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果與白色類諾卡氏菌(Nocardioides albus)屬的基本特征一致，同時(shí)，16S rDNA序列及同源性與Nocardioides albus的16S rDNA序列有99.0%同源性，并且在系統(tǒng)進(jìn)化樹上表明它和Nocardioides albus屬的菌具有較近的遺傳距離。因此，將其初步確定為白色類諾卡氏菌(Nocardioides albus)。

F1菌株在含油濃度0.3%、0.5%、1.0%土樣中降解原油的半衰期分別為17.2、18.2、23.7 d，42 d后均達(dá)到78%以上。

等量原油經(jīng)F1降解前后，表現(xiàn)出先降解高碳數(shù)正構(gòu)烷烴為低碳數(shù)正構(gòu)烷烴，高碳數(shù)正構(gòu)烷烴中奇數(shù)碳向偶數(shù)碳正構(gòu)烷烴演化規(guī)律，平均降油率為64%;F1菌株還能較好地促使五環(huán)三萜類化合物立體構(gòu)型中不穩(wěn)定構(gòu)型向穩(wěn)定性構(gòu)型轉(zhuǎn)化。

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