磷脂酰絲氨酸制備的研究進展

孫明波，劉天薇，王繼文，張怡軒*

(1.沈陽藥科大學生物制藥教研室，遼寧沈陽110016;2.沈陽天峰生物制藥有限公司，遼寧沈陽110003)

磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)又稱絲氨酸磷脂或二酰甘油酰磷酸絲氨酸，是一種天然磷脂，1942年由Jordi［1］首次提取并命名。磷脂酰絲氨酸并非單一成分，而是一組化合物，這是由于不同來源的原料所提取的產(chǎn)品的脂乙酰殘基的變化較大而造成。PS以甘油為主要骨架，1、2號碳原子上面連接脂肪酸，構(gòu)成它的非極性尾部，3號碳原子連接一個帶絲氨酸的磷脂，構(gòu)成它的極性頭部(圖1)。

1 磷脂酰絲氨酸的分布

磷脂酰絲氨酸存在于所有的動物、高等植物以及微生物的生物膜中。通過對典型的哺乳動物細胞中磷脂含量的研究發(fā)現(xiàn)，真核細胞膜中含量最豐富的磷脂為磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)，占總磷脂含量的40%～50%［1］。而PS含量相對較少，約占總磷脂含量的2%～10%。通過研究還發(fā)現(xiàn)，有機體不同組織中PS的含量不同，腦組織中的PS含量遠遠大于肝臟組織中［2-4］。在高等植物中，磷脂酰絲氨酸主要存在于植物種籽中，但含量并不高。在玉米種子中，磷脂酰絲氨酸的含量約為1.0%［5］，而在大豆中，磷脂類物質(zhì)占大豆總重的1.6%～2%，這其中磷脂酰絲氨酸只占0.5%～1%，即每千克大豆中只含有80～200 mg磷脂酰絲氨酸［6］。

圖1 磷脂酰絲氨酸結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of Phosphatidylserine

2 磷脂酰絲氨酸的制備方法

磷脂酰絲氨酸的制備方法比較多，其中主要以提取法和酶轉(zhuǎn)化法為主。

2.1 提取法

提取法主要是從植物種籽、動物的腦及肝臟中提取PS。由于植物中的PS含量較少，所以提取法以動物組織中提取為主。從動物中提取主要是動物的大腦及內(nèi)臟，目前國外提取PS大部分以牛、羊、兔、馬、驢等家畜的動物腦為原料。磷脂酰絲氨酸存在于組織的脂類物質(zhì)里，要想得到純凈的磷脂酰絲氨酸，首先要把粗磷脂從組織中進行濃縮分離，然后再通過TLC法、硅膠柱色譜法、氨基鍵合硅膠柱色譜法、高效液相色譜法等方法對粗磷脂進一步分離純化。粗脂質(zhì)的提取方法目前最常用的主要有氯仿-甲醇-水提取法［7-8］、己烷-異丙醇提取法等［7，9］。近年來由于瘋牛病的原因，利用動物大腦提取PS的方法獲得的產(chǎn)品安全性受到人們的懷疑，此種方法現(xiàn)在已處于淘汰邊緣。

2.1.1 氯仿-甲醇-水提取法1959年，Bligh等［8］以魚類肌肉組織為原料、氯仿-甲醇-水為溶劑進行粗脂質(zhì)的提取。取100 g鱈魚肌肉(含80%水分及1%磷脂)作為原料，在常溫下向組織中加入300 mL氯仿-甲醇(體積比1∶2)混合溶劑，搗碎2 min使其均勻分散，然后向混勻的混合物中加入100 mL氯仿并攪拌30 s，此后加入100 mL蒸餾水繼續(xù)攪拌30 s，產(chǎn)生溶解了脂質(zhì)的氯仿相和溶解了非脂質(zhì)的甲醇-水相，過濾，收集氯仿下清液，然后再加入一定量的甲醇-水溶液進一步除去剩余的油類雜質(zhì)，在氮氣條件下蒸除氯仿，再蒸干得粗磷脂。此種方法已被報導適用于魚類肌肉組織中粗磷脂酰絲氨酸的提取，且操作簡單，溶劑來源廣泛，處理量大，但是由于氯仿具有毒性，且成本較高，因此研究其他方法來替代氯仿萃取生產(chǎn)磷脂酰絲氨酸十分必要。

2.1.2 己烷-異丙醇提取法鑒于氯仿-甲醇-水提取法的毒害作用，1978年，Atsushi等［9］將1 g小鼠腦組織和18 mL己烷-異丙醇(體積比3∶2)混合均質(zhì)30 s，過濾后，所有的容器和組織殘留物再用己烷-異丙醇漂洗3次，然后收集到一起的溶液在12 mL硫酸鈉溶液(1 g固體硫酸鈉與12 mL水混合)中攪拌1 min，靜置分層，上層即為所需的粗脂質(zhì)層。Atsushi Hara等將此法與氯仿-甲醇-水提取法進行實驗比較發(fā)現(xiàn)，以1 g小鼠腦組織為原料，用氯仿-甲醇-水提取法提取出粗脂質(zhì)79.5 mg，含有3.2 mg蛋白質(zhì)脂質(zhì)蛋白;而用己烷-異丙醇提取法提取得到產(chǎn)物72.9 mg且未檢測到蛋白質(zhì)脂質(zhì)蛋白。由此可見，此法比氯仿-甲醇-水提取法更經(jīng)濟，對實驗者的安全更可靠，同時避免了蛋白質(zhì)脂質(zhì)蛋白的影響，在形成兩相時的沖洗時間更短，同時，溶劑密度低，足以通過離心作用得到勻漿，來替代其他溶劑的過濾作用，提取效果較好，洗凈的提取物可在遠紫外區(qū)用于色譜柱的連續(xù)監(jiān)測洗脫，但此方法不能對神經(jīng)節(jié)苷脂進行有效分離。

2.1.3 其他方法2005年，山東師范大學劉代成等［10］公布發(fā)明專利《一種從動物腦提取磷脂酰絲氨酸的方法》，其首先將干燥動物腦碎成0.2～0.4 cm的顆粒，再向顆粒中加入體積為3～5倍量的丙酮，攪拌萃取，除去含有干腦粒中膽固醇和油類的丙酮上清液，殘渣蒸干。然后向蒸干的殘渣中加入過量的乙醚，得到乙醚提取液，可蒸去大部分乙醚使剩余的乙醚溶液體積為乙醚提取的干物質(zhì)的3～5倍量。將該乙醚溶液加入到pH 7.5～11的Na2CO3水溶液中成鹽，攪拌1 h，-10～-20℃凍結(jié)，4～7℃緩慢解凍。除去下部沉淀，將上清液用2%～5%HCl調(diào)pH 3～6。蒸除乙醚，蒸干水分得干粉;或蒸除乙醚后加入與剩余溶液同量的正己烷，攪拌分層，取上部正己烷層，蒸去正己烷得干物質(zhì)。然后再向干物質(zhì)加入3～5倍正己烷，再加入體積5～10倍于干物質(zhì)量且含醋酸鈉的40%～60%乙醇溶液攪拌，靜止分層，除去下部白色沉淀(主要為肌醇磷脂)取上部正己烷層，蒸干得磷脂酰絲氨酸，磷脂酰絲氨酸純度為90%～93%。目前國內(nèi)西安楚康生物科技公司、西安三維生物技術(shù)有限公司、陜西信瑞生物科技有限公司等通過提取法從天然大豆榨油剩余物中提取的磷脂酰絲氨酸粗品已經(jīng)上市，美國的NATURE'S BOUNTY公司提取自純天然大豆卵磷脂中的磷脂酰絲氨酸已經(jīng)以軟膠囊的形式上市，并熱銷于國內(nèi)外。但是，磷脂酰絲氨酸的提取工藝用到大量的有機試劑，且工藝比較復雜，對于磷脂酰絲氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)很不利，提取法目前要解決的就是優(yōu)化提取工藝，用組成簡單且用量少的溶劑提取出較多的磷脂酰絲氨酸。

2.2 酶轉(zhuǎn)化法

酶轉(zhuǎn)化法主要是以天然的卵磷脂為基質(zhì)，加入L-絲氨酸，在磷脂酶D(phospholipase D，PLD)或磷脂酰絲氨酸合成酶(phosphatidylserine synthase，PSS)的作用下，生成磷脂酰絲氨酸(PS)。

磷脂酶D，即磷脂酰膽堿磷脂水解酶PLD(EC3.1.4.4)，廣泛存在于植物、動物及各種微生物如酵母、細菌中。磷脂酶D屬于催化磷酸二脂酯鍵水解和堿基交換反應(yīng)的一類酶的總稱，屬于磷脂酰二酯合成酶類，具有該家族的明顯特征，即含有2個間隔出現(xiàn)的H(x)K(x)4D保守序列，該保守基序是催化水解的活性部位。H(x)K(x)4D殘基在PLD活性中的作用已在酵母PLD特異位點誘變實驗中得到證明，改變其中任何一個殘基都會導致PLD活性的喪失［11］。試驗證明［12］，PLD以保守的組氨酸殘基對底物進行親和攻擊，通過兩步乒乓反應(yīng)機制水解斷裂P-O鍵，即PLD與磷脂酰膽堿(PC)首先形成一個復合物，而后PLD-PC復合物變?yōu)镻LD-磷脂酰?；鶑秃衔锊⑼瑫r釋放一個膽堿分子，此后，一個親核分子或水分子與化合物結(jié)合。最后，從復合物中釋放，合成一個新的磷脂。

磷脂酰絲氨酸合成酶(又稱絲氨酸-磷脂酰轉(zhuǎn)移酶:L-serineO-phosphatidyltransferase，PSS;EC 2.7.8.8)［13］，是磷脂酶D家族成員之一，可以催化底物相中的磷脂類物質(zhì)和水相中親核供體發(fā)生類似于酯縮合的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，是合成特定的新的磷脂類物質(zhì)的良好工具酶。PSS在細菌、酵母、哺乳動物細胞中均有發(fā)現(xiàn)，其中細菌類特別是大腸埃希菌(E.coli)具有培養(yǎng)容易、抗性強等諸多特點，為實驗研究的首選出發(fā)菌株。源自大腸埃希菌的磷脂酰絲氨酸合成酶通過催化特定的反應(yīng)，能夠合成大腸埃希菌自身所需的大部分磷脂類物質(zhì)。2.2.1磷脂酶D和PSS的來源Hanahan等最先從胡蘿卜根和白菜葉的提取物中獲得PLD酶，揭開了PLD研究的序幕。植物PLD主要集中于葉片、根和種子等器官中，并隨著植物生長發(fā)育的轉(zhuǎn)變而變化。1994年，王學敏等［14］以萌發(fā)中蓖麻種子的子葉為試材，經(jīng)過提取、分離與純化，獲得有活性的PLD酶。到目前為止已從蓖麻籽、擬南芥、草莓、豇豆、甘藍、煙草、茴芹、垂頭菊、棉花、水稻、玉米中分離克隆到完整的PLD cDNA序列，且其中已有部分得到純化。植物PLD由復雜的基因家族編碼，在擬南芥PLD基因研究中，已測定出7條編碼PLD的基因，其中4條位于染色體Ⅳ，2條位于染色體Ⅱ，1條位于染色體Ⅲ。PLDα基因位于染色體Ⅲ，PLDβ基因位于染色體Ⅱ，PLDγ和PLDγ2基因位于染色體Ⅳ，PLDγ基因簇中發(fā)現(xiàn)的第3種編碼PLD基因命名為PLDγ3，染色體Ⅳ和Ⅱ上的另外2條編碼PLD基因標記為PLDδ1和PLDδ2［15］。

PLD在各種微生物中也廣泛分布。至今已報導的產(chǎn)磷脂酶D的微生物主要有鏈霉菌、棒狀桿菌、大腸埃希菌、沙門菌以及假單胞菌。其中，磷脂酶D在鏈霉菌中分布最為廣泛，報導也最多。研究發(fā)現(xiàn)，微生物來源磷脂酶D與動植物來源磷脂酶D相比，具有較強的底物耐受性，較寬的底物專一性和較高的堿基交換反應(yīng)催化活性，更適合于工業(yè)應(yīng)用。在基因工程菌方面，1994年，Y等［16］成功地構(gòu)建含有鏈霉菌來源的PLD質(zhì)粒，并在大腸埃希菌表達系統(tǒng)中成功表達。

在哺乳動物細胞中PLD有PLD1和PLD2 2種亞型，PLD1主要位于核周圍，如高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體及其分泌囊泡，而PLD2主要位于質(zhì)膜上，2003年，朱玲等［17］從Daudi細胞中提取mRNA，經(jīng)剪切、拼接變構(gòu)，克隆獲得了不含膜結(jié)合部位及信號肽的，可編碼631個氨基酸的PLD2 cDNA序列。采用Vector NTI、DNATools等計算機分析軟件及信息庫，研究了重組人磷脂酶D2(rh-PLD2)變構(gòu)體的生物學特征。rhPLD2具有多種基因結(jié)構(gòu)和功能調(diào)控元件，朱玲等對其氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)在此氨基酸序列中還含有2個連接糖基側(cè)鏈的與天冬酰胺一致序列(Asn-Xaa-Thr/Ser)，分別是N-F-T(261～263)和N-A-T(564～566)，由于這2個潛在的糖基化位點的存在，其編碼的蛋白質(zhì)具有發(fā)揮功能所必需的活性保守基序和一定的空間結(jié)構(gòu)，因此推測rhPLD2應(yīng)是一種具有一定生物學功能的異質(zhì)性蛋白質(zhì)。

PSS目前在細菌、酵母和哺乳動物細胞中均有發(fā)現(xiàn)，其中，源自大腸埃希菌的磷脂酰絲氨酸合成酶具有PLD家族明顯的序列特征，即含有2個間隔出現(xiàn)的H(x)K(x)4D保守序列，它能夠催化合成大腸埃希菌自身所需的大部分磷脂類物質(zhì)，而不同于其他革蘭陰性菌的磷脂類物質(zhì)合成酶，并不緊密連接于細胞膜結(jié)構(gòu)。對其進一步定位研究發(fā)現(xiàn)，該酶是一種外膜蛋白，主要通過脂類底物和弱酸性磷脂物質(zhì)的電子傳遞鏈與膜表面互相作用。目前報導的PSS的來源方法主要是通過基因工程菌的構(gòu)建，來源于小麥、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌等的PSS均在大腸埃希菌表達系統(tǒng)中得以成功表達。

2.2.2 磷脂酰絲氨酸的酶法制備PLD是具有特殊性質(zhì)的酯鍵水解酶，它能水解磷脂分子中的P-O鍵，水解產(chǎn)物為磷脂酸和羥基化合物。除水解作用外，在特定條件下，還能催化一些含羥基的化合物結(jié)合到磷脂的?；?，形成新的磷脂，這一特性稱為PLD的堿基交換反應(yīng)。利用此特性可對磷脂進行改性，制備高純度的單一磷脂和稀有磷脂。以PC和L-絲氨酸為底物，可以進行磷脂酰絲氨酸的酶法合成。

1997年，De等［18］公布發(fā)明專利《Process for the industrial preparation of phosphatidylserine》，初步確定了工業(yè)化生產(chǎn)磷脂酰絲氨酸的流程。以來源于蛋黃的磷脂酰膽堿原料為例，13 g蛋黃卵磷脂(PC含量為60%)溶于158 mL甲苯中，加入38 g L-絲氨酸、1.4 g無水CaCl2以及由鏈霉菌ATCC 55717菌株發(fā)酵產(chǎn)生的PLD酶液300 mL，同時加入1.7 g醋酸鈉并加入冰醋酸使水溶液pH約為4.1，25℃強烈攪拌6 h后停止反應(yīng)，得到7.3 g PS。

2008年，西北大學楊志彪［5］對初步篩選得到的可以產(chǎn)生磷脂酶D的鏈霉菌通過單孢子分離純化菌種，挑選出產(chǎn)磷脂酶D能力較強的鏈霉菌菌株。通過對此鏈霉菌萌發(fā)處理的培養(yǎng)液在磁力攪拌器上邊攪拌邊進行紫外線誘變，進行了菌種選育，使菌種的產(chǎn)磷脂酶D能力提高了27%。同時，對發(fā)酵制備的酶液進行初步的分離純化處理，使得發(fā)酵液中磷脂酶D的活力提高了2.8倍。同時，對兩相體系合成磷脂酰絲氨酸的工藝進行研究，通過對緩沖液種類、絲氨酸用量、反應(yīng)體系有機溶劑的選擇、pH、溫度、兩相體積比、最適條件下酶液用量，以及分批攪拌補充酶液工藝的研究，確定了鏈霉菌PLD催化合成磷脂酰絲氨酸的基本工藝條件:絲氨酸以0.1 g/mL的濃度溶入濃縮的發(fā)酵酶液中，pH值5.5。此酶液與溶解有大豆磷脂的乙醚以1∶2的體積比混合，在28℃的條件下攪拌反應(yīng)。

2007年，天津科技大學李斌等［19］利用表達載體pET-22b，實現(xiàn)了大腸埃希菌磷脂酰絲氨酸合成酶PSS基因在大腸埃希菌BL21(DE3)中的同源高效表達，利用鎳親和柱對表達產(chǎn)物進行純化，將純化后的重組酶作用于底物卵磷脂和絲氨酸定向合成磷脂酰絲氨酸，制備和檢測方法如下:30 mL的0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 5.5)中含有0.15 mol/L絲氨酸，同時加入1 mL純化后的重組磷脂酰絲氨酸合成酶，與15 mL含有0.75 mmol卵磷脂的氯仿進行混合，在30℃下200 r/min混合得到均勻的乳狀液進行反應(yīng)。反應(yīng)6 h后，停止轉(zhuǎn)動，雙液相靜止分層。提有機相取1 mL，經(jīng)揮發(fā)后，剩余物經(jīng)氯仿洗滌2次，最后溶解于50 μL氯仿中，HPLC法分析產(chǎn)物生成量。采用的流動相為乙腈∶甲醇∶85%磷酸=100∶10∶0.8，檢測波長206 nm，樣品進樣量15 μL，流速為1.0 mL/min，利用外標法(以磷脂酰絲氨酸標準品為外標物)計算底物卵磷脂的轉(zhuǎn)化率。磷脂酰絲氨酸合成酶的酶活定義:pH 5.5、30℃下，每小時轉(zhuǎn)化1 μmol大豆卵磷脂所需要的酶量(mg)。經(jīng)6 h的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達到33%，重組磷脂酰絲氨酸合成酶PSS活力達到69 U/mg(蛋白)。同時，利用表達載體pET22-b(+)，實現(xiàn)了色褐鏈霉菌［20］磷脂酶D基因在大腸埃希菌BL21(DE3)中的高效表達。結(jié)果表明，目的蛋白可在短時間內(nèi)進行大量表達且轉(zhuǎn)酯反應(yīng)6 h后卵磷脂的轉(zhuǎn)化率達到31%，重組磷脂酶D活力達到39 U/mg(蛋白)。

2008年，天津科技大學申請了磷脂酰絲氨酸合成酶的制備方法專利［21］，采用枯草芽胞桿菌系統(tǒng)表達磷脂酰絲氨酸合成酶基因，解決了出發(fā)菌株磷脂酰絲氨酸合成酶(PSS)表達量低的問題，發(fā)酵后粗酶液經(jīng)硫酸銨鹽析、中空纖維膜除鹽濃縮、離子交換層析、凝膠層析等步驟可獲得高純度的磷脂酰絲氨酸合成酶，具有制備工藝簡單、酶活力高等優(yōu)點，克服了現(xiàn)有提取技術(shù)中大量有機溶劑使用的不足，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

3 磷脂酰絲氨酸的應(yīng)用

磷脂酰絲氨酸(PS)可由人體利用絲氨酸合成產(chǎn)生，它可影響腦內(nèi)化學訊息的傳遞，并幫助腦細胞儲存和讀取資料，是維持大腦正常記憶力、反應(yīng)和健康情緒的重要營養(yǎng)元素。其藥理作用表現(xiàn)在以下5方面:①改善記憶力、延緩腦疲勞，治療老年癡呆癥。A等［22］對有記憶損傷的年長大鼠進行莫理斯(Morris)水下迷宮逃生試驗研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠的空間回憶和被動回避反應(yīng)的記憶能力得到了大幅度改善;②治療兒童多動癥。內(nèi)科醫(yī)生的臨床試驗研究顯示，對21個多動癥患者(4～19歲)進行200～300 mg/d劑量的PS飲食攝入，連續(xù)攝入4周后發(fā)現(xiàn)，注意力和學習能力有顯著提高［23］;③緩解精神壓力。Hellhammer等［24］研究了大豆磷脂酸和磷脂酰絲氨酸混合物PAS對人精神壓力的影響，以安慰劑為對照進行社會壓力測驗(TSST)后，發(fā)現(xiàn)400 mg PAS對其有明顯緩解作用，且對心率無影響;④治療抑郁癥。Brambilla等［25］研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰絲氨酸能夠調(diào)節(jié)大腦中控制情緒的神經(jīng)遞質(zhì)的激素水平，患者抑郁度平均降低70%，情緒紊亂、行為異常、焦慮、易怒等癥狀得到了顯著改善;⑤競技運動營養(yǎng)。Kingsley等［26］研究發(fā)現(xiàn)，每天補充從大豆中提取的PS 750 mg，連續(xù)10 d，觀察力竭性間歇對身體機能的影響。實驗結(jié)果表明PS的補充能減少積累氧債并能提高運動耐力。

正是基于上述的認識，2006年5月，韓國食品醫(yī)藥品廳(KFDA)允許在添加PS的制品中突出表示，并宣傳相關(guān)產(chǎn)品有“防止老年人認識力低下”功能。同年10月，美國的食品醫(yī)藥品廳(FDA)通過GRAS(Generally Recognized As Safe，一般認定為安全的物質(zhì))認定，PS可作為營養(yǎng)強化型機能性食品素材添加在酸奶，奶粉，面包，粉末飲料等食品中。大量的科學試驗已經(jīng)證實，PS對于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，特別是大腦具有特異性的作用，而那些與年齡相關(guān)的認知能力降低(ARCD)和與年齡有關(guān)的記憶損傷(AAMI)患者，因為其自身不能合成足夠量的磷脂酰絲氨酸，外源性的磷脂酰絲氨酸將會使他們成為最大的受益者。由此可見，隨著世界范圍內(nèi)各種疾病的蔓延，健康越來越受到人們的重視，而對人體有重要作用的磷脂酰絲氨酸必將受到人們的廣泛關(guān)注，高品質(zhì)PS產(chǎn)品的研發(fā)將在食品、藥品、保健品方面有很大的應(yīng)用前景。

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