育泡飲對大鼠卵巢顆粒細胞間隙連接蛋白43表達及分泌功能的影響*

金 哲，李 楠，劉艷霞

育泡飲對大鼠卵巢顆粒細胞間隙連接蛋白43表達及分泌功能的影響*

金 哲，李 楠，劉艷霞

[目的]觀察育泡飲對體外培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細胞（GC）間隙連接蛋白43（CX43）表達及雌二醇（E2）分泌的影響，探索中藥促進卵泡發(fā)育的可能作用機制。[方法]制備大鼠卵巢顆粒細胞進行原代培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)48 h后，加入促卵泡激素（FSH）50 ng/mL和不同劑量的育泡飲，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，放免法測定顆粒細胞培養(yǎng)液中E2的含量，Western blot法檢測CX43蛋白的表達。[結(jié)果]1）育泡飲能夠促進卵巢顆粒細胞分泌E2，隨著藥物濃度的增大，E2分泌逐漸增加。2）育泡飲可明顯促進顆粒細胞CX43蛋白的表達，其中高劑量組的促進作用與FSH組作用相似。[結(jié)論]育泡飲能明顯促進卵巢顆粒細胞CX43蛋白的表達及E2分泌，說明育泡飲可通過上調(diào)CX43蛋白的表達促進顆粒細胞的增殖，增強顆粒細胞的抗凋亡能力，進而調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育。

育泡飲；卵巢顆粒細胞；間隙連接蛋白43；雌二醇；實驗研究

據(jù)統(tǒng)計，育齡夫婦中不孕癥的發(fā)生率為10%～15%[1]，其中以女性排卵障礙因素為主因的占20%～40%[2]。因此，深入研究卵泡發(fā)育成熟、排出的機制對提高生殖健康水平具有重要的意義。目前，排卵障礙的治療手段已形成完整體系，針對排卵障礙采取的誘發(fā)排卵治療，在臨床應用中取得了顯著的療效。然而用藥安全性，成為在輔助生殖領域進一步應用的瓶頸。近年來，隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代研究的不斷深入，中藥在促卵泡發(fā)育，調(diào)節(jié)卵巢功能方面的研究碩果累累，但其機制尚待明確?；诖?，以卵巢顆粒細胞為切入點，觀察中藥育泡飲對顆粒細胞分泌及間隙連接蛋白43（CX43）表達的影響，旨在從分子水平探索育泡飲促進卵泡發(fā)育，調(diào)節(jié)卵巢功能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 23~25日齡未成年雌性大鼠10只，體質(zhì)量（50±10）g，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物中心，合格證號：SCXK（京）2009-0007。

1.1.2 實驗藥物 中藥育泡飲：主要成分由紫河車、菟絲子、熟地黃、黨參、當歸等10味藥物組成，購自北京同仁堂股份有限公司。育泡飲水提醇沉液由北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院制劑室完成，制備為1 g/mL濃度的藥液，4℃冰箱保存。注射用重組人促卵泡激素（FSH75IU/支默克雪蘭諾公司，批號：Y15A8530）。

1.1.3 主要試劑和儀器 孕馬血清（PMSG）（內(nèi)蒙古赤峰博恩藥業(yè)有限公司）。胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、DMEM/F12培養(yǎng)基（美國GIBCO/BRL）。熒光素FITC（美國Sigma公司）。雌二醇（E2）放免試劑盒（北京北方生物技術研究所），兔FSHR抗體（北京百事創(chuàng)新公司），兔抗CX43單克隆抗體（上海優(yōu)寧維生物有限公司），GAPDH兔抗人單克隆抗體（SANT CRUZ公司），電化學發(fā)光免疫法（ECL）增強化學發(fā)光顯色試劑盒（武漢博士德）。倒置相差顯微鏡（OLYMPUSIMT-2），熒光顯微鏡（OLYMPUS BX51），電泳及轉(zhuǎn)膜設備（美國Bio-Rad公司），離心機（美國Sigma公司），CO2培養(yǎng)箱（美國NAPCOMODEL5410），超凈工作臺（北京昌平長城空氣凈化工程公司CJT-R-Ⅱ型），電熱恒溫水箱（上海實驗儀器廠，HH-W 21.420型）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠卵巢顆粒細胞原代培養(yǎng) 參照Lovekamp等[3]介紹的方法并加以改進，雌性SD大鼠10只，每只腹壁皮下注射PMSG 40 U，48 h后脫臼處死。置于75%乙醇中浸泡5 min，在無菌條件下取出卵巢放入預冷的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，去除卵巢周圍的組織及包膜，PBS清洗2遍后置于預冷的DMEM/F12培養(yǎng)基中。25號針頭刺破卵泡，釋放顆粒細胞入培養(yǎng)基，200目不銹鋼細胞篩過濾。1 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集顆粒細胞。向沉積在離心管底的細胞團中加入DMEM/F12培養(yǎng)基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素），制成單細胞懸液，0.4%臺盼藍染色，血細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞數(shù)目，細胞存活率>90%。按照不同實驗要求，將細胞懸液稀釋成相應的濃度。放免分析實驗為：5×105個/mL，接種于24孔板。蛋白印記實驗為1×106個/mL接種于6孔板。在37℃、5%CO2溫箱中預培養(yǎng)48 h。

1.2.2 顆粒細胞的鑒定 體外培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細胞，常規(guī)細胞爬片，應用蘇木-伊紅（HE）染色及細胞免疫熒光法鑒定顆粒細胞。

1.2.3 細胞分組 顆粒細胞在培養(yǎng)48 h后換液，共分5組：正常對照組，F(xiàn)SH對照組，育泡飲低、中、高劑量組。正常對照組加入含1%FBS的培養(yǎng)液，中藥組在含1%FBS的細胞培養(yǎng)液中分別加入不同濃度的育泡飲稀釋液（低劑量組，1×10-6g/mL；中劑量組，1×10-5g/mL；高劑量組，1×10-4g/mL），西藥對照組加入用1%FBS培養(yǎng)液稀釋后的FSH 50 ng/mL。放免分析實驗每組設5個復孔，蛋白印記實驗每組設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 培養(yǎng)液中E2含量的測定 用放免法測定各組顆粒細胞培養(yǎng)液中E2的含量。測定方法按照放免試劑盒說明書進行。批內(nèi)變異系數(shù)均小于5%，批間變異系數(shù)均小于10%。

1.2.5 Western blot測定顆粒細胞CX43蛋白的表達 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞2次，棄去PBS。加入400 μL蛋白裂解液，充分裂解細胞，100℃煮沸5 min，5 000 r/min離心2 min。用Bradford方法測定蛋白濃度，配置10%的分離膠和5%的積層膠，每泳道上樣50 μL，100 V電泳2 h。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液（溶于PBS液中）室溫封閉1.5 h，加入兔抗CX43蛋白單克隆一抗（1∶200）和 GAPDH 兔抗人單克隆一抗（1∶200），4℃孵育過夜，PBS溶液洗膜3次，每次15 min。加入羊抗兔 HRP 標記的二抗（1∶1 000），孵育 3 h，PBS洗膜3次，用ECL增強化學發(fā)光法顯色。X光片曝光顯影。采用Quantity One軟件進行對特異蛋白條帶進行灰度掃描和定量分析。結(jié)果判定：目的蛋白含量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 卵巢顆粒細胞培養(yǎng)及形態(tài)學觀察 卵巢顆粒細胞呈單層貼壁生長，培養(yǎng)12～24 h后細胞開始貼壁，48 h后細胞迅速增殖，生長旺盛，見圖1、圖2。

圖1 培養(yǎng)24 h后大鼠卵巢顆粒細胞（×10）

圖2 培養(yǎng)48 h后大鼠卵巢顆粒細胞（×10）

2.2 卵巢顆粒細胞的鑒定

2.2.1 HE染色 經(jīng)HE染色后，在鏡下觀察細胞呈多角形或梭形，胞核呈卵圓形，被染成深藍色，胞漿呈淡紅色，見圖3。

圖3 大鼠卵巢顆粒細胞HE染色（×10）

2.2.2 FSHR表達鑒定顆粒細胞 經(jīng)免疫細胞熒光染色后，在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示顆粒細胞有FSHR陽性表達，F(xiàn)SHR的陽性率>90%，見圖4。

圖4 大鼠卵巢顆粒細胞FSHR免疫細胞熒光染色（×400）

2.3 育泡飲對各組卵巢顆粒細胞分泌E2的影響見表1。由表1可見，育泡飲各劑量組和空白組相比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），隨著育泡飲藥物濃度的增大，E2的分泌逐漸增加。與FSH組相比較，育泡飲低劑量組與其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而育泡飲中、高劑量組與FSH組促進E2分泌的作用無明顯差異。

表1 育泡飲對各組卵巢顆粒細胞分泌E2的影響（±s）

表1 育泡飲對各組卵巢顆粒細胞分泌E2的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與 FSH 組比較，#P＜0.05。

組別藥物濃度孔數(shù)E2（pg/mL）空白組 - 5 175.56±19.00#FSH 組 50 ng/mL 5 320.20±65.30*育泡飲低劑量組 1×10-6g/mL 5 257.62±28.14*#育泡飲中劑量組 1×10-5g/mL 5 308.58±24.97*育泡飲高劑量組 1×10-4g/mL 5 319.88±33.10*

2.4 育泡飲對各組卵巢顆粒細胞CX43蛋白表達的影響 見圖5、表2。由表2可見，與空白組相比較，育泡飲各劑量組及FSH組CX43蛋白表達均明顯增加（P＜0.05）。與FSH組比較，育泡飲高劑量組

CX43蛋白的表達與之差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

育泡飲中、低劑量組較之明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而中、低劑量之間差異無統(tǒng)計學意義

（P＞0.05）。

表2 育泡飲對各組卵巢顆粒細胞CX43蛋白表達的影響（±s）

表2 育泡飲對各組卵巢顆粒細胞CX43蛋白表達的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與 FSH 組比較，#P＜0.05。

組別 藥物濃度 孔數(shù) CX43/GAPDH空白組 - 3 0.124±0.010#FSH 組 50 ng/mL 3 0.582±0.037*育泡飲低劑量組 1×10-6g/mL 3 0.354±0.026*#育泡飲中劑量組 1×10-5g/mL 3 0.374±0.023*#育泡飲高劑量組 1×10-4g/mL 3 0.604±0.028*

3 討論

間隙連接是細胞之間主要的一種連接方式，具有重要的通訊功能。卵巢卵泡在整個發(fā)育過程離不開細胞間的間隙連接。目前已知，CX43是卵巢間隙連接中主要的連接蛋白，主要表達于卵泡顆粒細胞（GC）之間。GC通過間隙連接調(diào)控卵母細胞的生長、分化和成熟，進而調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育。Ackert等[4]研究發(fā)現(xiàn)，CX43-/-小鼠卵泡僅發(fā)育至卵泡初級階段，卵母細胞及GC出現(xiàn)一定程度的空泡化，透明帶發(fā)育不良，卵母細胞不能恢復減數(shù)分裂，不能受精。這表明在卵泡的生長和發(fā)育過程中，CX43是顆粒細胞增殖所必需的，由于CX43的缺失導致GC分層失敗，將對卵泡的發(fā)育帶來嚴重的影響。卵泡的選擇與閉鎖有賴于GC的凋亡，目前研究還發(fā)現(xiàn)，CX43的表達與顆粒細胞的凋亡指數(shù)呈負相關[5]，CX43具有抗GC凋亡的能力，在卵泡選擇過程中起重要的作用。

現(xiàn)代研究表明，中醫(yī)藥在促進卵泡發(fā)育、調(diào)節(jié)卵巢功能、改善機體的內(nèi)分泌紊亂、調(diào)經(jīng)助孕方面有較好的療效，但其機制尚待明確。在總結(jié)以往治療排卵障礙性疾病經(jīng)驗的基礎上，提出卵子屬生殖之精的范疇，腎中精氣的充盛是卵子發(fā)育成熟的基礎，“任脈通、沖脈盛”是卵泡進一步生長成熟的條件。認為腎中精氣充沛，沖任氣旺血盛、運行調(diào)暢，則卵子生長、發(fā)育、排出正常，孕育有本[6-8]。以此為理論主導，應用育泡飲治療排卵障礙性疾病。方中紫河車乃血肉有情之品，補腎益精，養(yǎng)血益氣，培元固本；菟絲子、熟地黃補腎填精，贊化生育；黨參、當歸，氣血雙調(diào)，培補后天。諸藥合用，共奏補腎填精、益氣養(yǎng)血之效。

本實驗以體外培養(yǎng)卵巢顆粒細胞為研究對象，從蛋白水平對育泡飲促進卵泡發(fā)育的機制進行研究，結(jié)果表明：育泡飲可促進顆粒細胞E2的分泌，隨著藥物濃度的增大其分泌作用逐漸增強；育泡飲還能明顯促進CX43蛋白的表達，其中高劑量組的促進作用與FSH組作用相似。由此推測，育泡飲通過上調(diào)卵巢顆粒細胞CX43蛋白的表達，從而促進GC的增殖和分泌功能，增強GC的抗凋亡能力，進而調(diào)控了卵泡的發(fā)育。這可能是育泡飲影響卵泡發(fā)育、調(diào)節(jié)卵巢功能的重要分子基礎之一。

[1] 黃荷鳳.現(xiàn)代輔助生育技術[M].北京:人民軍醫(yī)出版社，2003:303-387.

[2] 張麗珠．臨床生殖內(nèi)分泌與不育癥[M]．北京：科學出版社，2001：446.

[3] Love kamp TN，Davis BJ．Mono-(2-ethylhexy)phthalate suppresses aromatase transcript levels and estradiol production in cultured rat granulose cells[J]．Toxicol Appl Pharmacol，2001,172(3):217-224.

[4] Ackert CL,Gitters JEI,0’Brien MJ，et al．Intercellular communication and connexin-43 gap junctions is required for ovarian follicular genes is in the mouse[J]．Dev Biol，200l，233(1):258-270.

[5] Dmitri V,Krysko SM，Lucl，et al．Gap junction communication and connexin-43.expression in relation to apoptotic cell death and survival of granulose cells[J].Endocrinology,2004，52:1199-1207.

[6] 劉艷霞.郭志強教授分期治療婦科病經(jīng)驗[J].北京中醫(yī)藥大學學報（中醫(yī)臨床版），2007，14（4）:19-21.

[7] 宋春敬，劉曉帆，孫艷明，等.滋腎調(diào)沖法對大鼠外周血內(nèi)皮細胞影響的實驗研究[J].天津中醫(yī)藥，2011，28（6）：493-495.

[8]李瑞環(huán)，王 玲，孫艷明，等.滋腎調(diào)沖法對誘發(fā)排卵大鼠卵巢血管內(nèi)皮生長因子表達的影響[J].天津中醫(yī)藥，2008，25（2）：144-146.

Effects of Yupao Yin on expression of CX43 in ovarian granulosa cells of rats and secretion function

JIN Zhe1,LI Nan2,LIU Yan-xia1
（1.Dong Fang Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100078,China;2.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China）

[Objective]To assess the effects of Yupao Yin on expression of CX43 in ovarian granulosa cells(GC)of rats and secretion quantity of E2.[Methods]Granulosa cells are isolated from rats ovaries and cultured for 48 hours,followed by culture in medium system containing FSH (50 ng/mL)and different dosage of Yupao Yin for 48 hours.The expression of CX43 is measured by western blot and the secretion quantity of E2is performed by radioimmunoassay.[Result]Yupao Yin can promote secretion of E2and the secretion quantity of E2gradually increases with the increase of the dosage.Yu pao Yin can significantly stimulate the expression of CX43.Amomg them the effect of high dosage group is similar with FSH group.[Conclusion]Yupao Yin obviously promote the expression of CX43 and secretion of E2of ovarian GC of rats.It is showed that Yupao Yin can promote proliferation of GC and enhance the ability of GC anti-apoptosis through up-regulation the expression CX43.And then to promote the development of follicular.

Yupao Yin;ovarian granulosa cells;connexin43;E2;experimental study

R285.5

A

1673－9043（2012）03－0147-04

北京中醫(yī)藥大學中青年教師資助基金項目（2009 JYBZZ-JS090）。

100078 北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院（金 哲，劉艷霞）100029 北京中醫(yī)藥大學（李 楠）

金 哲（1954-），女，主任醫(yī)師，教授，博士生導師，從事生殖內(nèi)分泌及不孕癥方面的研究與治療。*

劉艷霞。

2012-05-12）