牙鲆RAG2基因的質(zhì)粒構(gòu)建和體外原核表達(dá)

王先磊, 譚訓(xùn)剛 張培軍 徐永立

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071; 2. 青島國(guó)家海洋科學(xué)研究中心, 山東 青島 266071)

牙鲆RAG2基因的質(zhì)粒構(gòu)建和體外原核表達(dá)

王先磊1,2, 譚訓(xùn)剛1, 張培軍1, 徐永立1

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071; 2. 青島國(guó)家海洋科學(xué)研究中心, 山東 青島 266071)

將牙鲆(Paralichthys olivaceus)RAG2 cDNA序列插入到體外表達(dá)質(zhì)粒pProEXTM HT, 在大腸桿菌(Escherichiacoli) BL-21中進(jìn)行體外表達(dá), 分析了誘導(dǎo)時(shí)間和 IPTG濃度對(duì)重組蛋白產(chǎn)生量的影響,確定了最佳誘導(dǎo)條件為：誘導(dǎo)時(shí)間為3 h, IPTG誘導(dǎo)濃度0.2 mmol/L。本研究同時(shí)對(duì)RAG2重組蛋白的可溶性進(jìn)行確認(rèn), 并利用BD TALONTM 金屬親和柱純化了RAG2蛋白。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究RAG2蛋白的生物學(xué)功能奠定了良好的基礎(chǔ)。

牙鲆(Paralichthys olivaceus); RAG2; 重組; 純化

重組活化基因2(Recombination activating gene 2,RAG2)在基因序列上與 RAG1基因緊密相連, 對(duì)于淋巴細(xì)胞的V(D)J重排是必需的。如果缺失了RAG1或者 RAG2基因產(chǎn)物, 淋巴細(xì)胞無(wú)法發(fā)育成熟, 從而在小鼠(Mus musculus)和人體內(nèi)導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫缺陷[1]。

最初關(guān)于 RAG2蛋白的功能研究主要集中在哺乳動(dòng)物、兩棲類和鳥(niǎo)類[2-4], 隨著魚(yú)類疾病的頻繁發(fā)生和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展, 各國(guó)學(xué)者將目光開(kāi)始轉(zhuǎn)移到魚(yú)類的 RAG2基因功能研究, 目前虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[5-6]、斑馬魚(yú)(Denio rerio)[7-8]、紅鰭東方豚(Fugu rubripes)[9]、鯽魚(yú)(Carassius auratus)[10]、草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)[11]等硬骨魚(yú)類的 RAG2基因已得到克隆, 而軟骨魚(yú)的代表物種鯊魚(yú)(Rhizoprionodon lalandii)RAG2基因也得到克隆[12], 其在硬骨魚(yú)類體內(nèi) mRNA水平的時(shí)空表達(dá)情況也進(jìn)行了分析[13]。研究發(fā)現(xiàn), 目前已知的所有生物的RAG2的基因序列內(nèi)沒(méi)有內(nèi)含子。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是中國(guó)北方重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種, 目前, 病害的頻繁發(fā)生嚴(yán)重阻礙了牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。為了保證牙鲆產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定、健康、持續(xù)發(fā)展, 通過(guò)研究牙鲆免疫系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)和功能而提高牙鲆抵抗病原菌侵害的能力是一條重要的途徑[14]。RAG2基因產(chǎn)物對(duì)于魚(yú)類免疫系統(tǒng)的發(fā)育具有重要意義。

在機(jī)體內(nèi)真正起作用的是蛋白質(zhì), 只有蛋白質(zhì)時(shí)空表達(dá)的確定才能更真實(shí)有效地反映免疫細(xì)胞和器官發(fā)揮作用的時(shí)間和空間分布。目前關(guān)于硬骨魚(yú)類 RAG2生物學(xué)功能研究基本上是在 mRNA水平,為進(jìn)一步研究在蛋白水平 RAG2的生物學(xué)功能, 本研究在本實(shí)驗(yàn)室的研究[15-16]及克隆了的牙鲆 RAG2基因的基礎(chǔ)上, 構(gòu)建了RAG2體外原核表達(dá)質(zhì)粒, 并進(jìn)行了原核表達(dá)和純化, 為 RAG2蛋白抗體制備奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

限制性內(nèi)切酶(TaKaRa, 大連), T4Ligase (Ta-KaRa, 大連),Pfupolymerase(Shanghai Promega,上海), 蛋白 Marker(上海生物所), BD TALONTMMetal Affinity Resins(Clontech, USA)。

大腸桿菌(Escherichiacoli)BL-21及質(zhì)粒pBluescriptⅡSK, pProEXTMHT由本試驗(yàn)室保存。

1.2 引物序列

1.3 重組表達(dá)菌獲得

依據(jù)GST Gene Fusion System手冊(cè)(Amersham Pharmacia Biotech, USA。GST Gene Fusion System,Third Edition, Revision2,1997)[17], 將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL-21, 獲得重組表達(dá)菌株。

1.4 IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)重組蛋白表達(dá)量的影響

按照 Qiagen公司(Qiagen, UAS。The QIAexpressionist? fifth edition- A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins,2003)蛋白表達(dá)及純化手冊(cè)進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。IPTG的誘導(dǎo)濃度為 0.2、0.4、0.6、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mmol/L。

1.5 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)量的影響

實(shí)驗(yàn)方法同 1.4, 只是 IPTG誘導(dǎo)濃度為 0.6 mmol/L, 第一次取樣時(shí)間為誘導(dǎo)后1 h, 此后每隔1 h取樣, 共取至第6小時(shí), 探討其誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)量的影響。

1.6 蛋白可溶性確定

將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液5 mL 12 000g離心1 min, 收集菌體, PBS洗滌后加入1 mL PBS重懸菌體。超聲破碎菌體后, 12 000g離心1 min。取上清, 加等體積2×蛋白處理液, 然后沸水浴5 min, 取20 μL電泳。沉淀加 500 μL PBS重懸, 加等體積 2×樣品處理液,沸水浴5 min, 取10 μL電泳。

1.7 RAG2蛋白純化

按照 Qiagen公司蛋白表達(dá)及純化手冊(cè)(Qiagen,UAS。The QIAexpressionist? fifth edition-A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins, 2003)進(jìn)行蛋白的純化。

1.8 SDS-PAGE檢測(cè)

蛋白電泳用SDS-PAGE電泳, 濃縮膠濃度為5%,分離膠濃度為8%。電泳采用恒流, 電流強(qiáng)度10 mA?？捡R斯亮藍(lán)R250進(jìn)行染色, 7%的醋酸進(jìn)行脫色。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及重組蛋白分子量確定

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室獲得的牙鲆 RAG2的基因序列,設(shè)計(jì)特異性引物(R2F7, R2R7, 引物序列見(jiàn) 1.2), 利用Pfu聚合酶擴(kuò)增牙鲆RAG2 cDNA的全序列; 將得到的基因片段插入到pBluescriptⅡSK的SmaⅠ位點(diǎn);通過(guò)酶切將RAG2基因片段轉(zhuǎn)移到帶6組氨酸標(biāo)簽的pProEXTM HT表達(dá)質(zhì)粒, 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。測(cè)序確認(rèn) RAG2基因插入方向及閱讀框架的正確性。成功構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒圖譜見(jiàn)下圖：

重組質(zhì)粒插入的RAG2基因的全長(zhǎng)為1602 bp,可以編碼533個(gè)氨基酸, 加上pPROEXTMHT表達(dá)質(zhì)粒的氨基酸片段, 表達(dá)的融合蛋白 RAG2的分子量理論值為60 kDa。

2.2 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)量的影響

當(dāng)培養(yǎng)溫度為 37℃, IPTG誘導(dǎo)濃度為 0.6 mmoL/L時(shí), 加入誘導(dǎo)劑IPTG后1 h, SDS-PAGE電泳的結(jié)果顯示, 在接近預(yù)測(cè)重組蛋白分子量的位置附近出現(xiàn)了一條新的蛋白條帶, 與預(yù)測(cè)的 RAG2重組蛋白的分子量60 kDa接近, 可以確認(rèn)為該蛋白條帶為帶6組氨酸標(biāo)簽的RAG2重組蛋白(圖1)。

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), RAG2蛋白的表達(dá)量也不斷增加。到3 h, RAG2蛋白的表達(dá)量達(dá)到最大, 在此后的研究時(shí)間段內(nèi) RAG2蛋白的表達(dá)量變化不大。因此, 在以后誘導(dǎo)RAG2蛋白表達(dá)時(shí), 誘導(dǎo)時(shí)間定為3 h。

圖1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)RAG2蛋白表達(dá)量的影響Fig. 1 The effect of induction time on the expression of recombinant RAG2 protein

2.3 IPTG濃度對(duì)重組蛋白產(chǎn)生量的影響

當(dāng)培養(yǎng)溫度為 37℃, 誘導(dǎo)時(shí)間為 2 h時(shí), 盡管IPTG濃度(0.2 ～4.0 mmoL/L)變化比較大, 但是其對(duì)RAG2蛋白的重組表達(dá)量的影響卻變化不大(圖2),因此在大量表達(dá)RAG2蛋白時(shí), IPTG濃度用最小濃度0.2 mmoL/L對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)即可。

2.4 蛋白可溶性確定

菌體經(jīng)超聲破碎后電泳結(jié)果顯示, 上清中幾乎沒(méi)有目的蛋白帶, 而沉淀中主要以目的蛋白為主,這說(shuō)明 RAG2蛋白是主要以包涵體的形式存在于宿主細(xì)胞中(圖3)。

圖2 IPTG濃度對(duì)RAG2蛋白表達(dá)量的影響Fig. 2 The effect of IPTG concentration on the expression of recombinant RAG2 protein

圖3 RAG2蛋白可溶性的確定Fig. 3 Determination of the solubility of the recombinant RAG2 protein

2.5 RAG2蛋白親和柱純化

將菌體離心后, 用變性裂解緩沖液裂解后, 加入到BD TALONTM金屬親和柱, 通過(guò)緩沖液pH逐漸降低的梯度變化, 進(jìn)行純化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 當(dāng)緩沖液pH為8.0和6.3時(shí), 洗滌液中沒(méi)有目的蛋白, 當(dāng)pH降到4.5時(shí), 在對(duì)應(yīng)的RAG2蛋白的位置出現(xiàn)了單一的蛋白電泳條帶(圖4, 帶6-9), 說(shuō)明攜帶組氨酸序列標(biāo)簽表達(dá)的 RAG2蛋白可以結(jié)合到 BD TALONTM Metal Affinity Resins親和柱, 通過(guò)pH的改變, RAG2蛋白可被洗脫下來(lái), 并且蛋白純化效果比較好。

圖4 體外重組表達(dá)蛋白的純化Fig. 4 Purification of recombinant RAG2 protein

3 討論

對(duì)原核表達(dá)載體作者使用了帶 6組氨酸標(biāo)簽的pPROEXTMHT表達(dá)質(zhì)粒, 6組氨酸標(biāo)簽可與 BD TALONTM 金屬親和柱結(jié)合, 從而將目的蛋白吸附在親和柱上, 通過(guò)改變pH值梯度變化進(jìn)行洗脫, 從而獲取高純度的目的蛋白。得到的 RAG2蛋白電泳后分子量比理論分子量偏大, 這可能是由于在重組蛋白前面加上一段帶6組氨酸的載體序列造成的。

重組蛋白的表達(dá)量受到宿主菌、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)物濃度的影響。作者最終使用的宿主菌株是大腸桿菌 BL-21, 作者實(shí)驗(yàn)初期使用的菌株是大腸桿菌DH 5α, 但是沒(méi)有誘導(dǎo)出 RAG2蛋白的表達(dá)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有列出), 可能大腸桿菌DH 5α不適合RAG2蛋白的表達(dá), 說(shuō)明選擇合適的宿主菌對(duì)于重組蛋白在原核表達(dá)是一個(gè)重要的因素。重組蛋白表達(dá)量的多少與誘導(dǎo)物的濃度和誘導(dǎo)時(shí)間有密切關(guān)系, 本實(shí)驗(yàn)所用的誘導(dǎo)物為IPTG, 由于IPTG本身有毒性, 而且價(jià)格較貴, 經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化, 最終IPTG誘導(dǎo)濃度為0.2 m moL/L。誘導(dǎo)時(shí)間實(shí)驗(yàn)顯示, 經(jīng)過(guò)IPTG的誘導(dǎo), 菌體很快產(chǎn)生目的蛋白, 隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加, 重組蛋白的量不斷增加, 到3 h時(shí), 重組蛋白表達(dá)量達(dá)到最大值, 此后進(jìn)入平臺(tái)期, 因此作者使用的誘導(dǎo)時(shí)間為3 h。

外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物, 通常可以以可溶性和不可溶(即包涵體)的形式存在。RAG2蛋白主要以包涵體的形式存在于宿主菌中, 由于包涵體的不溶性、致密性和相對(duì)穩(wěn)定性, 通過(guò)超聲波破碎、離心可以很容易地進(jìn)行初級(jí)分離。純化后, 通過(guò)在包涵體中加入含尿素的變性裂解緩沖液, 打開(kāi)蛋白中的次級(jí)鍵, 使組蛋白標(biāo)簽暴露出來(lái), 與樹(shù)脂上的Co2+離子結(jié)合。另外, 在沉淀中發(fā)現(xiàn)了大量的目的蛋白存在(圖3), 可能是由于在將重懸浮液放到搖床上振蕩得不夠充分, 大多數(shù)包涵體都沒(méi)有溶解, 可以將沉淀用變性裂解液重新懸浮, 通過(guò) BD TALONTM 金屬親和柱進(jìn)一步進(jìn)行純化, 提高目的蛋白的回收率。

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Construction and expression of a prokaryotic vector of recombinant olive flounder RAG2

WANG Xian-lei1,2, TAN Xun-gang1, ZHANG Pei-jun1, XU Yong-li1
(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071, China; 2. National Oceanographic Center, Qingdao 266071, China)

Nov.,4,2011

Olive flounder (Paralichthys olivaceus); RAG2; recombination; purification

The full length of olive flounder RAG2 cDNA was ligated to plasmid pPROEXTM HT, and was transferred intoEscherichia coli(BL-21) for recombinant protein expression. It showed that the protein expression was induced by IPTG. The optimal concentration of IPTG and optimal induction time were 0.2 mmoL/L and 3 h, respectively. The recombinant RAG2 protein was purified by BD TALONTM Metal Affinity Resins. This study will be useful for further research on the function of flounder RAG2.

Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-3096(2012)09-0059-05

2011-11-04;

2012-02-17

國(guó)家863計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012AA092203); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30800838); 山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y2008E12)

王先磊(1976-), 女, 山東膠南人, 助理研究員, 博士, 主要從事海洋生物學(xué)研究, 電話：0532-80970745, E-mail：wxl@nocq.org;譚訓(xùn)剛, 通信作者, 電話：0532-82898559, E-mail：tanx@qdio.ac.cn

譚雪靜)