過氧化物酶體增殖激活受體γ激動劑對高血壓患者外周血單核來源巨噬細胞血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2 mRNA表達的影響

李永勤，王世捷，王聰霞，高登峰，丁抗寧，牛小麟

1西安交通大學醫(yī)學院第二醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710004 2西安交通大學醫(yī)學院生理與病理生理學系，西安 710061

過氧化物酶體增殖激活受體γ激動劑對高血壓患者外周血單核來源巨噬細胞血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2 mRNA表達的影響

李永勤1，王世捷2，王聰霞1，高登峰1，丁抗寧1，牛小麟1

1西安交通大學醫(yī)學院第二醫(yī)院心內(nèi)科，西安 7100042西安交通大學醫(yī)學院生理與病理生理學系，西安 710061

目的觀察過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARγ)激動劑對高血壓患者外周血單核來源巨噬細胞血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)mRNA表達的影響。方法將57例高血壓病患者隨機分為常規(guī)治療組 (n=18)、替米沙坦組 (n=19)和貝那普利組 (n=20)，并以20名正常血壓者為對照。測定各組外周血單核來源巨噬細胞ACE2 mRNA表達及治療4、12周后ACE2 mRNA表達的變化情況。結(jié)果治療4、12周后，替米沙坦組和貝那普利組的收縮壓和舒張壓明顯低于常規(guī)治療組 (P均＜0.01)，替米沙坦組又明顯低于貝那普利組 (P均＜0.01)。高血壓各組外周血中單核來源巨噬細胞ACE2 mRNA的表達均明顯低于對照組 (P均＜0.01);治療4、12周后，替米沙坦組和貝那普利組的ACE2 mRNA表達均明顯高于常規(guī)治療組 (P均＜0.01)，替米沙坦組又明顯高于貝那普利組 (P均＜0.01)。結(jié)論PPARγ激動劑可增加高血壓患者外周血單核來源巨噬細胞ACE2 mRNA的表達。

過氧化物酶體增殖激活受體γ激動劑;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2;原發(fā)性高血壓

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)-血管緊張素 (1～7)-Mas受體 ［ACE2-Ang(1～7)-Mas］軸的作用是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)中重要的組成部分，其作用主要是對抗ACE-AngⅡ-AT1軸的作用，以維持機體內(nèi)環(huán)境的平衡［1］，尤其在心血管病理生理改變中 (如高血壓、心力衰竭及血管、心肌重塑等)發(fā)揮著重要的作用［2］，已成為近年研究熱點。本研究以外周血單核來源巨噬細胞ACE2 mRNA的表達為研究指標，觀察了高血壓患者ACE2 mRNA的表達情況，評估了過氧化物酶體增殖激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)激動劑對ACE2 mRNA表達的影響，以期進一步明確ACE2在高血壓發(fā)生、發(fā)展中的作用。

對象和方法

對象及分組 2008年3月至2010年3月在西安交通大學醫(yī)學院第二醫(yī)院心內(nèi)科門診就診的高血壓患者57例，其中，男30例，女27例，年齡46～68歲，排除繼發(fā)性高血壓、嚴重腎功能損害、肝功能損害、肥厚型心肌病、冠心病、風濕性心臟病、糖尿病、心功能衰竭以及對替米沙坦、貝那普利過敏者。入選患者行常規(guī)血壓測定、血生化檢查 (包括肝腎功能、血糖、血脂測定)，行心電圖、X線胸片及心臟B超檢查。高血壓診斷符合1999年世界衛(wèi)生組織與國際高血壓學會 (WHO/ISH)高血壓治療指南中的診斷標準［收縮壓＞140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和/或舒張壓＞90 mmHg］?；颊甙措S機原則分為3組:(1)常規(guī)治療組 (n=18):降壓藥物可在鈣離子拮抗劑的基礎(chǔ)上加用β受體阻滯劑和利尿劑;(2)替米沙坦組 (n=19):在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用替米沙坦80 mg/d;(3)貝那普利組 (n=20):在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用貝那普利10 mg/d。對照組為2008年3月至2010年3月在西安交通大學醫(yī)學院第二醫(yī)院門診行體格檢查血壓正常的健康對照者20人，在性別、年齡方面與高血壓組相比差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。高血壓各組在鈣離子拮抗劑、β受體阻滯劑和利尿劑的用藥劑量方面差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。

給藥時機 試驗開始前已在服用降壓藥物者，至少停服原降壓藥物5個半衰期，若血壓水平達到入選標準，則進入本研究;初診高血壓者，兩次就診血壓符合入選標準直接進入。4周、12周后復診。

血壓檢測 固定醫(yī)生，采用水銀柱血壓計測定坐位血壓，共測量3次，取其平均值作為觀測血壓值。

外周血中單核來源巨噬細胞的分離及鑒定 取10 ml EDTA抗凝血以等體積生理鹽水稀釋后，依密度梯度離心法用淋巴細胞分離液2000 r/min、4℃離心20 min，分離出外周血單個核細胞，加入含10%類標準胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄去非貼壁細胞，予0.25%胰蛋白酶收集貼壁單核巨噬細胞。用生理鹽水洗滌1次，分裝在1.5 ml Eppdorf管中。純化后的單核細胞經(jīng)抗 CD14單抗的流式細胞技術(shù) (flow cytometry，F(xiàn)CM)及瑞氏染色證實，純度均在80%以上。

巨噬細胞ACE2 mRNA表達的檢測 采用RTPCR方法，參照試劑盒要求提取細胞總RNA，取2 μl RNA樣本加98 μl 1‰ DEPC水。在紫外分光光度儀上測總RNA濃度及純度，D260 nm/D280 nm以1.8～2.0為佳。再取 2 μg總 RNA進行 RT-PCR。ACE2引物(賽百盛基因技術(shù)有限公司合成):上游5'-CATTGGAGCAAGTGTTGGATCTT-3'，下游 5'-GAGCTAATGCATGCCATTCTCA-3'，擴增 片 段 為 108 bp。GAPDH(賽百盛基因技術(shù)有限公司合成):上游5'-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3'，下游 5'-TCTCGCTCCTGGAAGATGG-3'，擴增片段為216 bp。按下列條件進行擴增:94℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，53℃退火30 s，68℃延伸1 min，循環(huán)35次，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳，重復6次，凝膠成像系統(tǒng)分析光密度值，并與內(nèi)參照GAPDH的比值作為半定量指標。

統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，結(jié)果以均數(shù)±標準差來表示，多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，多個樣本均數(shù)的兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

各高血壓組治療前后血壓的變化 治療前，各高血壓組的收縮壓和舒張壓差異無統(tǒng)計學意義 (P均＞0.05);治療4和12周后，替米沙坦組和貝那普利組的收縮壓和舒張壓均明顯低于常規(guī)用藥組 (P均＜0.01)，替米沙坦組的收縮壓和舒張壓又明顯低于貝那普利組 (P均＜0.01)(表1)。

各組外周血中單核來源巨噬細胞ACE2 mRNA的表達情況 治療前，對照組、常規(guī)治療組、貝那普利組和替米沙坦組外周血單核來源巨噬細胞ACE2/GAPDH的比值分別為0.83±0.06、0.43±0.05、0.45±0.08和0.40±0.07，其中，常規(guī)治療組、貝那普利組和替米沙坦組均明顯低于對照組 (P均＜0.01)。治療4周后，常規(guī)治療組、貝那普利組和替米沙坦組外周血單核來源巨噬細胞ACE2/GAPDH的比值分別為0.45±0.09、0.62±0.03和0.78±0.06，其中，貝那普利組和替米沙坦組均明顯高于常規(guī)治療組及治療前 (P均＜0.01)，替米沙坦組又明顯高于貝那普利組 (P＜0.01)。治療12周后，常規(guī)治療組、貝那普利組和替米沙坦組外周血單核來源巨噬細胞 ACE2/GAPDH的比值分別為0.51±0.04、0.64±0.05和0.80±0.06，其中，貝那普利組和替米沙坦組均明顯高于常規(guī)治療組及治療前 (P均＜0.01)，替米沙坦組又明顯高于貝那普利組 (P＜0.01)。

討 論

近年來，ACE2的發(fā)現(xiàn)使人們對RAS有了新的認識。ACE2是在2000年從人心力衰竭cDNA文庫和人淋巴瘤文庫中克隆出來的一種含有805個氨基酸的ACE類似物，也是Ⅰ型結(jié)構(gòu)的鋅依賴性膜金屬蛋白酶，在催化區(qū)域與ACE有42%的同源性。研究證實，ACE2的主要功能是水解AngⅡ，生成另一種血管活性肽Ang(1～7)［3］。Ang(1～7)的主要作用是對抗AngⅡ?qū)C體的不利影響，如收縮血管升高血壓、促進動脈粥樣硬化、促進心肌肥厚及間質(zhì)纖維化、損害血管內(nèi)皮功能等［4-5］。以往研究提示，ACE2基因是高血壓相關(guān)基因，自發(fā)性高血壓大鼠 (spontaneous hypertension rat，SHR)和鹽敏感sabra高血壓大鼠(salt sensitive sabra hypertensive rat，SBH)在發(fā)生高血壓后ACE2的mRNA和蛋白水平均明顯降低［6］。Mercure等［7］研究亦顯示，ACE2失活的 C57BL/6大鼠基礎(chǔ)血壓相比對照組有一定升高，提示ACE2的活性及其基因表達在高血壓的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

表1 各組治療前后血壓的變化 (± s，mmHg)Table 1 Changes of blood pressure in different groups(± s，mmHg)

表1 各組治療前后血壓的變化 (± s，mmHg)Table 1 Changes of blood pressure in different groups(± s，mmHg)

1 mmHg=0.133 kPa;與常規(guī)治療組比較，aP＜0.01;與貝那普利組比較，bP＜0.011 mmHg=0.133 kPa;aP＜0.01 compared with regular treatment group;bP＜0.01 compared with benazepril group

收縮壓Systolic blood pressure 舒張壓Dystolic blood pressure分組Group n 治療前Before treatment治療4周4 weeks after treatment治療12周12 weeks after治療12周12 weeks after treatment治療前Before treatment治療4周4 weeks after treatment treatment常規(guī)治療組Regular treatment group貝那普利組Benazepril group替米沙坦組Telmisartan group 18156.5±5.8140.2±6.7137.2±4.3 20157.1±6.2134.1±8.5a 95.5±6.290.6±5.487.9±7.3 131.4±6.8a 19157.9±4.3125.6±5.5ab 96.4±5.784.4±6.3a 83.5±4.9a 122.3±7.2ab 97.4±4.978.7±3.8ab 77.3±5.1ab

目前針對ACE2-Ang(1～7)-Mas這一新代謝軸與心血管疾病的研究大多局限于動物實驗，這主要是因為人體心肌、血管組織需用創(chuàng)傷性手段方可采集，因而限制了該領(lǐng)域的臨床研究。Keidar等［8］研究發(fā)現(xiàn)，人外周血單核來源巨噬細胞與心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞一樣，能夠表達ACE mRNA和ACE2 mRNA，參與炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)、血管活性因子的調(diào)控等病理生理過程，且具有易于采集的優(yōu)點。Keidar等［9］研究顯示，體外分離培養(yǎng)的單核來源巨噬細胞對醛固酮拮抗劑干預(yù)后表現(xiàn)為ACE mRNA下調(diào)及ACE2 mRNA顯著上調(diào)，這與在體動物心肌、血管組織在醛固酮干預(yù)之下的變化相一致。因此認為患者外周血中單核來源巨噬細胞可作為對RAS新代謝軸作用研究的媒介，由此間接反映心肌、血管組織中ACE2的作用。

替米沙坦是一種AT1受體拮抗劑，理論上能夠完全阻斷AngⅡ?qū)C體的不利作用，而且與ACEI相比，因為不影響緩激肽的代謝，所以沒有干咳的不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用的耐受性更好。有研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素受體拮抗劑可使ACE2的活性以及基因表達增加，從而將AngⅡ轉(zhuǎn)換為Ang(1～7)發(fā)揮拮抗AngⅡ的作用，這也是血管緊張素受體拮抗劑產(chǎn)生有利作用的一種重要機制［10-11］。本研究結(jié)果顯示，替米沙坦組經(jīng)治療4、12周后，血壓控制優(yōu)于常規(guī)治療組和貝那普利組，患者耐受性好，無1例發(fā)生不良反應(yīng)而停用藥物。經(jīng)治療后患者外周血單核來源巨噬細胞ACE2 mRNA的表達明顯上調(diào)，提示替米沙坦可能是通過阻斷AT1受體，拮抗AngⅡ經(jīng)AT1受體介導的血管收縮、升高血壓作用，并上調(diào)ACE2 mRNA，增強ACE2活性，使Ang(1～7)的生成增加，從而發(fā)揮擴張血管和舒張血壓的作用。

有研究顯示，替米沙坦是一種PPARγ激動劑［12］。PPARγ是核受體超家族成員之一，被其激動劑特異激活后能改善胰島素抵抗，降低血管平滑肌細胞胞內(nèi)Ca2+濃度和血管張力，多水平抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的活性，改善血管內(nèi)皮功能，降低交感神經(jīng)活性從而達到降壓的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者使用替米沙坦后，其外周血中單核來源巨噬細胞ACE2 mRNA的表達明顯升高，且替米沙坦組ACE2 mRNA的表達明顯高于貝那普利組，推測替米沙坦增強ACE2 mRNA表達與PPARγ激活，抑制AngⅡ、ACE活性以及AT1受體有關(guān)。另外Ang(1～7)主要通過ACE分解代謝，應(yīng)用ACEI貝那普利后Ang(1～7)分解減少，可能對ACE2產(chǎn)生反饋抑制，從而抵消了部分ACEI增高ACE2的作用，但關(guān)于替米沙坦優(yōu)于貝那普利增強ACE2表達的機制還有待進一步研究。

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Effect of Peroxisome Proliferator Activated Receptor γ Agonist on Angiotensin Converting Enzyme 2 mRNA Expression in Monocyte-derived Macrophages of Essential Hypertensive Patients

LI Yong-qin1，WANG Shi-jie2，WANG Cong-xia1，GAO Deng-feng1，DING Kang-ning1，NIU Xiao-lin1

1Department of Cardiology，the Second Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，China2Department of Physiology and Pathophysiology，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China

WANG Shi-jie Tel:029-81906067，E-mail:wang.shi.jie@stu.xjtu.edu.cn

ObjectiveTo study the effect of peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ)agonist on the angiotensin converting enzyme 2(ACE2)mRNA expression in monocyte-derived macrophages of essential hypertensive patients.MethodsTotally 57 essential hypertensive patients were randomly divided into three groups:conventional treatment group(n=18)，telmisartan group(n=19)，and benazepril group(n=20);20 patients with normal blood pressure were also selected as the control group.Monocyte-derived macrophages were isolated from blood samples of patients in all four groups.The expression of ACE2 mRNA in monocyte-derived macrophages was detected by RT-PCR before treatment and 4 and 12 weeks after treatment.ResultsFour and 12 weeks after treatment，the systolic pressure and diastolic pressure of telmisartan group and benazepri group were significantly lower than that of the conventional treatment group(allP＜0.01)，and the systolic pressure and diastolic pressure of telmisartan group were significantly lower than that of the benazepri group(bothP＜0.01).The expression of ACE2 mRNA in monocyte-derived macrophages were significantly lower in essential hypertensive patients than that in control group(P＜0.01).After having been treated for 4 weeks and 12 weeks，the expression of ACE2 mRNA in monocyte-derived macrophages of hypertensive patients in telmisartan and benazepril groups were significantly higher than that in conventional treatment group(allP＜0.01)，and the expression of ACE2 mRNA in telmisartan group was significantly higher than that in benazepril group(bothP＜0.01).ConclusionPPARγ agonist could increase the ACE2 mRNA expression in monocyte-derived macrophages of essential hypertensive patients.

peroxisome proliferator activated receptor γ agonist;angiotensin converting enzyme 2 mRNA;essential hypertension

Acta Acad Med Sin，2012，34(4):379-383

王世捷 電話:029-81906067，電子郵件:wang.shi.jie@stu.xjtu.edu.cn

R544.1

A

1000-503X(2012)04-0379-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.04.013

陜西省科技攻關(guān)項目［2007K13-03(13)］Supported by the Key Science and Technology Program of Shaanxi Province，China［2007K13-03(13)］

2011-11-13)