一種高效誘導胚胎胰腺細胞分化為內分泌細胞培養(yǎng)方法的建立

陳 芳，馬鳳霞，池 穎，趙欽軍，楊少光，盧士紅，韓忠朝

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 血液學研究所＆血液病醫(yī)院實驗血液學國家重點實驗室，天津 300020

一種高效誘導胚胎胰腺細胞分化為內分泌細胞培養(yǎng)方法的建立

陳 芳，馬鳳霞，池 穎，趙欽軍，楊少光，盧士紅，韓忠朝

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 血液學研究所＆血液病醫(yī)院實驗血液學國家重點實驗室，天津 300020

目的建立一種使胚胎胰腺細胞體外高效分化為成熟內分泌細胞的培養(yǎng)方法。方法體外分離小鼠12.5 d的胚胎胰腺，培養(yǎng)于下層為培養(yǎng)基的漂浮膜上7 d，采用免疫組織化學方法檢測胰腺祖細胞標志胰腺十二指腸同源盒基因1(PDX-1)和神經源素3(Ngn3)的表達及內、外分泌細胞的標志胰島素、胰高血糖素、羧肽酶表達，定量PCR檢測培養(yǎng)過程中胰腺標志表達的變化。結果胚胎胰腺培養(yǎng)1 d后，有大量胰腺祖細胞標志表達，且這些胰腺祖細胞處于增殖狀態(tài)。培養(yǎng)3 d后，仍有胰腺祖細胞的標志大量表達。培養(yǎng)7 d后，分化的胰腺表達成熟內、外分泌細胞的標志，且胰腺標志的表達與體內表達模式一致。結論建立了一種使胚胎胰腺細胞體外高效分化為成熟內分泌細胞的培養(yǎng)方法。

胰腺;胰島素;腺十二指腸同源盒基因1;神經源素3

中國糖尿病發(fā)病率已高達9.6%，其中以2型糖尿病為主，所占比例達到93.7%，1型糖尿病約占5%，其他類型糖尿病僅占0.7%，糖尿病已經成為繼腫瘤、心血管病變之后位居第三的嚴重威脅人類健康的慢性疾?。?］。隨著胰島移植技術的發(fā)展，胰島移植成為治療胰島素依賴型糖尿病的一種有效方法。有研究顯示，胰島移植不僅能夠糾正糖代謝的紊亂，而且能夠防止或逆轉糖尿病的血管病變，為徹底治療糖尿病帶來希望［2-3］。但是，供體胰腺的不足限制了胰島移植的廣泛開展，目前迫切需要尋找β細胞的新來源。最近，誘導全能的胚胎干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法取得了很大進步，但是這種方法需要加大量的誘導因子，而且需要嚴格控制誘導因子的劑量和誘導時間，更重要的是難以產生成熟的、功能和體內β細胞類似的胰島素分泌細胞［4-5］。因此，胰腺祖細胞成為最有應用前景的β細胞新來源。成體胰腺是否存在胰腺祖細胞現(xiàn)還存在爭論［6-7］。胚胎胰腺富含大量的胰腺祖細胞，而且具有高增殖及低免疫原性的優(yōu)點［8］。由于胰腺祖細胞缺乏特異的表面標志，分離胰腺祖細胞有很大困難，并且由于胰腺祖細胞數(shù)量少，尚缺乏高效誘導胰腺祖細胞分化為胰島素分泌細胞的方法。本研究建立了一種新的能在體外誘導胚胎胰腺細胞高效分化為內分泌細胞的培養(yǎng)方法。

材料和方法

主要試劑 PRMI-1640培養(yǎng)基 (美國 Gibco公司)，胎牛血清 (美國Hyclone公司)，牛血清白蛋白、抗胰島素抗體、抗胰高血糖素抗體、抗羧肽酶抗體、FITC標記的抗兔IgG、Texas red標記的抗小鼠IgG(美國Sigma公司)，逆轉錄試劑盒 (德國Qiagen公司)，LCR膜 (美國Millipore公司)，SYBR Green PCR master mix(美國Applied Biosystems公司)。

實驗動物 6～8周齡成年雌性及雄性昆明小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。雌、雄性小鼠按2∶1的比例合籠，第2天早上雌、雄性分開，檢查雌性小鼠的陰道拴來判斷是否懷孕，懷孕小鼠的胚胎計為0.5 d，12 d后取孕鼠的胚胎用來分離胚胎胰腺。

小鼠胚胎胰腺的分離 脫頸椎處死孕12.5 d的小鼠，酒精消毒后，打開腹腔，剪開子宮，把小鼠胚胎置于冰D-Hanks鹽溶液中，在體視顯微鏡下，首先切除胚胎的頭和四肢，再切除脊柱，然后切除肝臟以上部分。在紅色的肝臟下方可看到白色的胃和胰腺，切除肝臟，再仔細把胰腺和胃分開。

胚胎胰腺的培養(yǎng) 取直徑為35 mm的培養(yǎng)皿或六孔培養(yǎng)板中加入2 ml PRMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、1%非必需氨基酸和2 mmol/L谷氨酰胺。LCR膜是一種親水性的聚四氟乙烯膜，把LCR膜平鋪于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，由于浮力作用LCR膜漂浮于培養(yǎng)基中。將分離好的孕12.5 d的胚胎胰腺組織(E12.5)置于LCR膜上，處于氣體和液體的分界面上 (圖1)，于飽和濕度、5%CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次，培養(yǎng)7 d。

圖1 胚胎胰腺培養(yǎng)方法示意圖Fig 1 Illustration of culture method for embryonic pancreata

熒光免疫組織化學染色及定量 將胰腺組織固定于3.7%甲醛溶液中1 h，預包埋在4%低熔點瓊脂糖中，然后包埋在石蠟中。包埋的胰腺組織切片后，常規(guī)脫蠟至水，抗原修復后，3%BSA阻斷非特異性結合，0.1%或0.3%triton透膜。加一抗于4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入熒光標記的抗一抗的二抗常溫避光孵育2 h，洗滌二抗后，Hoechst孵育10 min染細胞核，TBST洗滌3次后封片，熒光顯微鏡下觀察染色情況并拍照。為了定量胰島素、胰高血糖素等的表達，整個胰腺組織所有切片的1/3被拍照。用圖像分析軟件IP lab定量每張照片中胰腺標志的染色，同樣定量Hoechst染色，兩者比值作為胰腺標志的表達率。

總RNA提取及實時熒光定量PCR 采用RNeasy微量試劑盒提取胰腺組織的總RNA，并用DNA酶處理以去除DNA污染。將50 ng RNA逆轉錄成cDNA，合成的cDNA被稀釋10倍，取5 μl用于PCR反應。實時熒光定量PCR采用7300系統(tǒng)，反應體系包括SYBR Green熒光染料、反應混合物、引物。將cyclophilin A作為內對照，應用相對定量的比較方法(2-ΔΔct)計算每個基因的表達水平。E15.5d胚胎胰腺的cDNA作為標準樣品。

統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據以均數(shù)±標準差表示，組間數(shù)據比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

培養(yǎng)過程中胚胎胰腺形態(tài)和結構的變化 分離的小鼠孕12.5 d胚胎胰腺由表皮和間充質兩部分組成，胰腺間充質位于外周包圍著胰腺表皮。當胚胎胰腺培養(yǎng)于漂浮的膜上時，其形態(tài)、結構發(fā)生明顯變化。未經培養(yǎng)的胚胎胰腺表皮和間充質體積相似，隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，間充質體積逐漸縮小，表皮體積逐漸增大，胚胎胰腺的密度逐漸增加;培養(yǎng)7 d時，間充質基本消失，胚胎胰腺的密度明顯高于未培養(yǎng)時 (圖2)。

胰腺祖細胞標志表達的變化 胚胎胰腺培養(yǎng)1 d后，有大量胰腺十二指腸同源盒基因1(pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)表達，PDX-1表達率為 (41±1)%;摻入BrdU的PDX-1陽性細胞占總PDX-1陽性細胞的 (29±2)%，多靠近間充質 (圖3)。培養(yǎng)3 d后，有大量神經源素3(neurogenin 3，Ngn3)表達，Ngn3表達率為 (12±2)%(圖4)。培養(yǎng)7 d后，胚胎胰腺大量表達胰島素，胰島素陽性細胞的核表達PDX-1(圖5A);胰島素陽性細胞和胰高血糖素陽性細胞聚集在一起形成類似胰島的結構 (圖5B);胚胎胰腺表達外分泌細胞的標志羧肽酶 (carboxypeptidase，CPA)，而且胰島素陽性細胞和CPA陽性的細胞完全沒有重疊 (圖5C);成熟的β細胞增殖率非常低，僅存在極少量胰島素BrdU雙陽性細胞，與體內胰腺類似 (圖5D);用不同濃度的葡萄糖刺激培養(yǎng)7d的胰腺，結果顯示高濃度葡萄糖能明顯刺激胰島素分泌 (圖5E)。

圖2 胚胎胰腺培養(yǎng)過程中形態(tài)變化 (×50)Fig 2 Morphological change of embryonic pancreata during culture(×50)

圖3 胚胎胰腺培養(yǎng)1 d后PDX-1的表達 (×200)Fig 3 Expression of PDX-1 in embryonic pancreata after cultured for 1 day(×200)

圖4 胚胎胰腺培養(yǎng)3 d后Ngn3的表達 (×200)Fig 4 Expression of Ngn3 in embryonic pancreata after having been cultured for 3 days(×200)

圖5 胚胎胰腺培養(yǎng)7 d后內、外分泌標志的表達Fig 5 Expression of endocrine and exocrine markers in embryonic pancreata after having been cultured for 7 days

胚胎胰腺培養(yǎng)過程中胰腺特異性標志表達的變化實時熒光定量PCR結果顯示，胚胎胰腺培養(yǎng)過程中，PDX-1表達逐漸降低 (圖6A)，Ngn3表達逐漸增加，第3天時達最高。3 d后Ngn3表達逐漸下降 (圖6B)。剛分離的胚胎胰腺幾乎不表達胰島素，培養(yǎng)3 d后，胰島素僅有少量表達，培養(yǎng)7 d后，胰島素大量表達 (圖6C)。β細胞的另一個標志Znt8和胰島素的表達相一致 (圖6D)。胰腺外分泌的標志淀粉酶的表達也和胰島素類似 (圖6F)。胰高血糖素的表達在剛分離的胚胎胰腺中表達較高，隨著胰腺祖細胞分化，胰高血糖素表達逐漸下降，第3天時表達最低，但隨著成熟α細胞出現(xiàn)，胰高血糖素表達逐漸增加 (圖6E)。

圖6 胚胎胰腺培養(yǎng)過程中胰腺標志的表達Fig 6 Expression of pancreatic markers in embryonic pancreata during culture

討 論

為了誘導胰腺細胞分化，目前大部分研究者采用單層培養(yǎng)或接種在matrigel上的三維培養(yǎng)，但誘導分化效率低，而且需要大量細胞因子［9-10］。本研究建立了一種新的培養(yǎng)方法，即使無任何誘導因子加入也能使胚胎胰腺細胞體外高效分化為內分泌細胞，該方法具有以下優(yōu)點:(1)培養(yǎng)方法簡單:直接培養(yǎng)胰腺組織，省略了把胰腺消化成細胞的步驟，維持了胰腺間充質和表皮的相互作用。胰腺間充質在胰腺發(fā)育過程中可發(fā)揮重要作用，不僅能促進胰腺祖細胞增殖，維持胰腺祖細胞處于不分化狀態(tài)［11］，還可控制胰腺表皮的發(fā)育進程［12］。本研究結果也顯示，隨著間充質體積逐漸縮小，表皮體積逐漸增大，胰腺祖細胞逐漸分化。(2)有利于內分泌細胞分化:本研究中分化胰腺的胰島素和胰高血糖素表達率分別為10.2%和5.4%，遠高于體內胰腺。(3)體外誘導胚胎胰腺分化過程與體內相一致:培養(yǎng)過程中，胰腺祖細胞及內、外分泌細胞標志的表達與體內一致。本研究中，體外培養(yǎng)的胰腺具有類似于活體胰腺的功能，外源性葡萄糖可以刺激其胰島素分泌增加，25 mmol/L葡萄糖刺激的胰島素釋放量是5 mmol/L葡萄糖的10倍左右。尤值一提的是，本研究所培養(yǎng)的胰腺組織取自小鼠胚胎12.5 d，此時胚胎胰腺組織含有大量祖細胞，相比較于晚期階段，這種早期階段的胰腺具有更低的免疫原性［8］。由于目前移植的最大障礙是免疫排斥的問題，這種培養(yǎng)的低免疫原性早期階段的胰腺或許能夠改善移植排斥問題。而且，胚胎胰腺體外培養(yǎng)7 d時，胰腺祖細胞已分化出內分泌和外分泌細胞，可大大減少其移植應用中的致瘤性問題。體外培養(yǎng)胰腺組織中細胞的活性也與移植密切相關，在本組之前的研究中，大鼠胚胎胰腺體外培養(yǎng)14 d能夠保持很好的活性［13］。

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Establishment of a New Method to Induce the Differentiation of Embryonic Pancreatic Cells into Mature Endocrine Cells

CHEN Fang，MA Feng-xia，CHI Ying，ZHAO Qin-jun，YANG Shao-guang，LU Shi-hong，HAN Zhong-chao

State Key Laboratory of Experimental Hematology，Institute of Hematology and Hospital of Blood Diseases，CAMS and PUMC，Tianjin 300020，China

MA Feng-xia Tel:022-23909349，E-mail:mafengxia@gmail.com

ObjectiveTo establish a new culture method to induce the differentiation of embryonic pancreatic cells into mature endocrine cells.MethodsMouse embryos at day 12.5 were used and embryonic pancreata were isolated.The isolated embryonic pancreata were cultured on the filter for 7 days，which floated in the dish containing medium.During culture，the expression of pancreas duodenum homeobox-1(PDX-1)，a pancreatic stem cell marker，was examined at day 1.The expression of neurogenin 3(Ngn3)，a pancreatic progenitor cell marker，was examined at day 3.The expressions of endocrine and exocrine markers，insulin，glucagon，and carboxypeptidase(CPA)were examined at day 7 by immunohistochemistry.The kinetics of pancreatic marker expression during culture was assayed by real-time PCR.ResultsMany pancreatic stem cells still existed in embryonic pancreata cultured for 1 day;meanwhile，these pancreatic stem cells proliferated in high rate.A large amount of pancreatic progenitor cells were found in embryonic pancreata c ultured for 3 days.Pancreatic stem/progenitor cells differentiated into mature endocrine and exocrine cells in embryonic pancreata after having been cultured for 7 days.Furthermore，the expression pattern of pancreatic marker is consistent with thatin vivo.ConclusionWe successfully established a new culture method，with which embryonic pancreatic cells can efficiently differentiate into mature endocrine cell.

pancreas;insulin;pancreas duodenum homeobox-1;neurogenin 3

Acta Acad Med Sin，2012，34(4):343-347

馬鳳霞 電話:022-23909349，電子郵件:mafengxia@gmail.com

R318.15

A

1000-503X(2012)04-0343-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.04.006

天津市應用基礎及前沿技術研究計劃 (09JCYBJC09700)Supported by the Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology(09JCYBJC09700)

2011-11-27)

·綜 述·