異丙酚和地卓西平馬來(lái)酸鹽對(duì)電休克后抑郁模型大鼠學(xué)習(xí)記憶和Tau蛋白過(guò)度磷酸化的影響

劉 超，閔 蘇，魏 珂，劉 東，董 軍，羅 潔，黎 平，劉小濱

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，重慶 400016 2天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，天津 300211

異丙酚和地卓西平馬來(lái)酸鹽對(duì)電休克后抑郁模型大鼠學(xué)習(xí)記憶和Tau蛋白過(guò)度磷酸化的影響

劉 超1，閔 蘇1，魏 珂1，劉 東2，董 軍1，羅 潔1，黎 平1，劉小濱1

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，重慶 4000162天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，天津 300211

目的觀察異丙酚和地卓西平馬來(lái)酸鹽 (MK-801)對(duì)電休克 (ECT)后抑郁模型大鼠學(xué)習(xí)記憶和Tau蛋白過(guò)度磷酸化的影響。方法按析因設(shè)計(jì)干預(yù)因素，即ECT(2水平:無(wú)處置和1個(gè)療程ECT)和藥物 (3水平:腹腔注射生理鹽水、異丙酚和MK-801)，采用Morris水迷宮檢測(cè)認(rèn)知能力，高效液相色譜法檢測(cè)谷氨酸 (Glu)含量，Western blot檢測(cè)Tau5、PHF-1(pSer396/404)、AT8(pSer199/202)、12E8(pSer262)在大鼠海馬中的表達(dá)。結(jié)果異丙酚、MK-801及ECT均可造成大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，ECT可明顯增加海馬中Glu濃度，異丙酚可降低海馬中Glu濃度，MK-801對(duì)海馬中Glu濃度無(wú)明顯影響。ECT可增加海馬中磷酸化Tau蛋白的表達(dá)，異丙酚和MK-801可減少海馬中磷酸化Tau蛋白的表達(dá)。結(jié)論異丙酚和MK-801可能是通過(guò)降低海馬Glu濃度，減緩Tau蛋白的磷酸化程度，進(jìn)而改善認(rèn)知能力。

異丙酚;N-甲基-D-天門冬氨酸受體拮抗劑;電休克;學(xué)習(xí)記憶;Tau蛋白

電休克 (electroconvulsive therapy，ECT)后出現(xiàn)的認(rèn)知障礙與谷氨酸 (glutamic acid，Glu)濃度過(guò)高引起的興奮性毒性［1］及其誘發(fā)的氧化應(yīng)激有關(guān)［2］。Glu對(duì)學(xué)習(xí)記憶具有雙向作用，適當(dāng)濃度的Glu可激動(dòng)N-甲基-D-天門冬氨酸受體 (N-methyl-d-aspartate receptor，NMDAR)，有助于記憶形成［3］;但若 Glu過(guò)高，則會(huì)過(guò)度激動(dòng)Glu受體，導(dǎo)致Ca2+大量?jī)?nèi)流，進(jìn)而激活對(duì)Ca2+敏感的酶，產(chǎn)生氧自由基，破壞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。Glu系統(tǒng)過(guò)度激活可誘導(dǎo)海馬Tau蛋白過(guò)度磷酸化［4］。Tau蛋白集中分布在軸突和樹(shù)突，為高度不對(duì)稱的磷蛋白，可促進(jìn)軸突微管的裝配和穩(wěn)定，影響神經(jīng)細(xì)胞軸突的物質(zhì)運(yùn)輸，促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育［5］，其磷酸化程度是調(diào)節(jié)Tau蛋白功能的主要手段［6］。Tau被異常磷酸化后可發(fā)生錯(cuò)誤折疊、分子聚集［7］，削弱其結(jié)合穩(wěn)定微管的功能，造成遞質(zhì)運(yùn)輸障礙，導(dǎo)致認(rèn)知障礙［8］。異丙酚可作為NMDAR拮抗劑發(fā)揮作用［9］，可抑制Glu的生成、釋放和轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，其苯環(huán)基團(tuán)可非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗NMDAR，縮短興奮性突觸后電位持續(xù)時(shí)間，減輕ECT導(dǎo)致的認(rèn)知障礙［1，10］。本研究評(píng)估了 Glu受體拮抗劑地卓西平馬來(lái)酸鹽 (dizocilpine maleate，MK-801)和異丙酚對(duì)ECT后抑郁模型大鼠學(xué)習(xí)記憶和Tau蛋白磷酸化的影響。

材料和方法

主要試劑及儀器 純品MK-801(美國(guó)Sigma公司)，異丙酚 (英國(guó)阿斯利康公司)，色譜級(jí)L-谷氨酸 (L-Glutamic acid，美國(guó) Sigma公司)，小鼠抗牛Tau5單克隆抗體 (美國(guó) Millipore公司)，兔抗牛PHF-1(pSer396/404)單克隆抗體 (英國(guó)Abcam公司)，兔抗人AT8(pSer199/202)多克隆抗體 (美國(guó)Invitrogen公司)，兔抗人12E8(pSer262)多克隆抗體 (美國(guó)Life Span Biosciences公司);DAB顯色試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 (上海碧云天公司);HPD-25D型無(wú)油隔膜真空泵 (上海魯碩公司)，YDJZ-Ⅱ型醫(yī)用微型電動(dòng)磨鉆 (上?；鄱鞴?，Harvard嚙齒類動(dòng)物電休克儀 (美國(guó)自然基因有限公司)，Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng) (北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，高效液相色譜 (high performance liquid chromatography，HPLC)色譜系統(tǒng) (美國(guó) Waters公司)，蛋白電泳系統(tǒng) (美國(guó)Bio-rad公司)，金盤多媒體圖像處理系統(tǒng) (成都金盤公司)，光學(xué)顯微照相系統(tǒng)(Olympus-45，日本Olympus公司)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立 24周健康雄性SD大鼠，體重250～300 g，由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，置通風(fēng)良好、12 h明暗交替、自由飲水?dāng)z食條件，每日觸摸2 min。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，建立嗅球切除抑郁模型［11-12］:2.75%戊巴比妥鈉 (55 mg/kg)皮下注射麻醉，在兩耳聯(lián)線中點(diǎn)切皮，暴露顱骨，在距前囟前7～8 mm、正中縫兩側(cè)旁開(kāi)2 mm的交點(diǎn)，鉆2個(gè)直徑2 mm小孔，用探針攪動(dòng)破壞嗅球后用真空泵將破壞的嗅球組織全部吸出。以吸收性明膠海綿填入止血，青霉素 (20萬(wàn)U/ml)沖洗，縫合皮膚，肌注青霉素鈉4萬(wàn)U/只，連續(xù)給藥3 d。術(shù)后每日對(duì)大鼠撫摸、稱重，2周后進(jìn)行曠場(chǎng)測(cè)試，于晨9時(shí)開(kāi)始，選取水平計(jì)分和垂直計(jì)分之和在30～90分間的48只大鼠。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，按美國(guó)醫(yī)學(xué)研究協(xié)會(huì)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理原則》及美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和處理指南》進(jìn)行，行孤籠飼養(yǎng)，循雙盲原則。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組 采用2×3析因設(shè)計(jì):將每只大鼠視為1個(gè)單位，予兩個(gè)處理因素，即ECT(2水平:無(wú)處置、施行1療程ECT)和藥物 (3水平:腹腔注射生理鹽水、異丙酚、MK-801)，共6組。將48只嗅球切除抑郁模型大鼠隨機(jī)分為6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組8只:Ⅰ組 (5 ml生理鹽水 ip)，Ⅱ組 (5 ml MK-801 ip，10 mg/kg)，Ⅲ組 (5 ml MK-801 ip，10 mg/kg+1個(gè)療程ECT)，Ⅳ組 (5 ml異丙酚ip，200 mg/kg)，Ⅴ組 (5 ml異丙酚 ip，200 mg/kg+1個(gè)療程 ECT);Ⅵ組 (5 ml生理鹽水ip+1個(gè)療程ECT)。

ECT處置 施行ECT前15 min注射相應(yīng)藥物，于大鼠雙顳側(cè)安放電極，采用Harvard嚙齒類動(dòng)物電休克儀行ECT處理，予方波 (單個(gè)正弦半波20 ms)，電流50 mA，頻率50 Hz，持續(xù)1 s電刺激，引起強(qiáng)直陣攣抽搐發(fā)作視為ECT成功［13］，隔天1次，共7次，均于晨9時(shí)進(jìn)行。不施行ECT的組在同樣時(shí)間、以同樣頻率和劑量注射相應(yīng)藥物。

大鼠學(xué)習(xí)記憶功能檢測(cè) 采用Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)，全部ECT結(jié)束后行Morris水迷宮檢測(cè)。Morris水迷宮均分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個(gè)象限。訓(xùn)練前，水迷宮內(nèi)盛自來(lái)水，加墨汁使水渾濁，檢測(cè)前將平臺(tái)置Ⅰ象限水面下2 cm。實(shí)驗(yàn)在9:00～15:00間進(jìn)行，保持室內(nèi)安靜，物品放置及燈光狀態(tài)一致，水溫 (24±1)℃。Morris 1.0軟件跟蹤記錄分析相關(guān)數(shù)據(jù)。第1～6天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn):檢測(cè)前將平臺(tái)置Ⅰ象限正中水面下2 cm，按逆時(shí)針?lè)较蚍謩e從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個(gè)象限將大鼠面向池壁置水中，觀察計(jì)時(shí)120 s。攝像記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)的時(shí)間，計(jì)為逃避潛伏期;若120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則引其至平臺(tái)，停留30 s，逃避潛伏期記為120 s。檢測(cè)結(jié)束后以第1～6天逃避潛伏期的平均值為學(xué)習(xí)成績(jī)，越短顯示大鼠的學(xué)習(xí)能力越好。第7天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn):撤平臺(tái)，將大鼠從距原平臺(tái)最遠(yuǎn)的Ⅲ象限面向池壁放入水中，攝錄大鼠在60 s內(nèi)各象限游泳時(shí)間，以原平臺(tái)象限Ⅰ象限游泳時(shí)間即空間探索時(shí)間作為記憶成績(jī)，越長(zhǎng)顯示大鼠記憶能力越好。

樣本采集及保存 Morris水迷宮測(cè)試結(jié)束后取海馬，具體為:麻醉后快速斷頭取腦，在DEPC冰面上吸除血跡，分離海馬，左側(cè)海馬用錫箔紙包裹，置液氮中過(guò)夜，然后-80℃保存;右側(cè)海馬稱重，加1 ml甲醇-水離心液，低溫勻漿，4℃ 10 000×g離心15 min，取上清液，濾膜過(guò)濾后-80℃保存。

海馬中Glu含量的檢測(cè)

樣本:處理好的右側(cè)海馬勻漿上清液。

試劑:Glu色譜級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品，OPA(分析純，上海碧云天公司)，β-巰基乙醇 (美國(guó) Amresco公司)，甲醇 (色譜級(jí)，上海碧云天公司)。

儀器及色譜條件:Centrifuge 5810R型低溫高速離心機(jī) (德國(guó)Eppendof公司);HPLC色譜系統(tǒng) (美國(guó)Waters公司)，包括600泵、熒光2475檢測(cè)器、Empower色譜工作站;18-ODS色譜柱 (美國(guó)Dima公司)，柱溫35℃。流動(dòng)相A:0.1 mol/L醋酸鉀，流動(dòng)相B:甲醇。進(jìn)行二元梯度洗脫，梯度洗脫程序:(T，B%)(0，45%)(1，65%)(6，75%)(20，45%)，T指時(shí)間 (單位:min)，B%指B流動(dòng)相所占的比例。流動(dòng)相經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，超聲脫氣。流速1.0 ml/min，激發(fā)波長(zhǎng)250 nm，發(fā)射波長(zhǎng)410 nm，以Glu峰面積定量。

衍生化試劑配制:將20 mg OPA溶于500 μl甲醇中，超聲溶解，加入β-巰基乙醇500 μl，再加入9 ml pH 10.0的硼酸緩沖液，避光密封后0～4℃保存。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液配制:Glu標(biāo)準(zhǔn)品配成100 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)前稀釋。取100 μl標(biāo)準(zhǔn)液或者組織樣品液置EP管中，加100 μl衍生化試劑反應(yīng)2 min，進(jìn)樣 20 μl。

Glu標(biāo)準(zhǔn)曲線建立:配制濃度分別為0.150、0.300、0.735、1.470、2.940、3.675、5.880 mg/L的Glu標(biāo)準(zhǔn)溶液，衍生化處理后測(cè)定。采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，以峰面積 (Y)對(duì)其濃度 (X)進(jìn)行直線回歸，得到線性方程。

Glu含量測(cè)定:每1 ml勻漿上清液加0.75 ml 4%碳酸氫鈉溶液混勻，4℃ 3000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，分裝。然后取該分裝液24 μl，在進(jìn)樣瓶中加入衍生試劑12 μl，四硼酸鈉緩沖液 (pH 9.18)960 μl，混勻，溫度控制在20℃下靜置3 min后依次進(jìn)樣，梯度洗脫，測(cè)定Glu含量。

海馬中Tau蛋白含量檢測(cè) 取左側(cè)海馬勻漿，取0.2 g經(jīng)Western blot檢測(cè)及IP細(xì)胞裂解液提取蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，據(jù)此調(diào)節(jié)蛋白濃度一致。取等量蛋白樣品，用5×SDS加樣緩沖液按體積比1∶1稀釋待測(cè)樣品，于100℃煮沸5 min;另用1×SDS加樣緩沖液溶解預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)混合物，于100℃煮沸3 min。取待測(cè)標(biāo)本15 μl上樣 ［甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GRPDH)作為蛋白質(zhì)上樣量的標(biāo)定］，經(jīng)SDS-PAGE電泳至預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)混合物所示目的條帶出現(xiàn)為止，濕法將蛋白條帶電轉(zhuǎn)至Immun-blot PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉封閉3 h，加相應(yīng)抗體 ［小鼠抗牛Tau5單克隆抗體、兔抗牛PHF-1(pSer396/404)單克隆抗體、兔抗人AT8(pS-er199/202)多克隆抗體、兔抗人12E8(pSer262多克隆抗體)(1∶200)］，4℃孵育過(guò)夜，用相應(yīng)辣根酶標(biāo)記IgG(1∶200)37℃孵育2 h，DAB顯色，金盤多媒體圖像處理系統(tǒng)測(cè)定陽(yáng)性條帶的積分光密度值。

結(jié) 果

MK-801、異丙酚和ECT對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響 MK-801、異丙酚和ECT均可造成學(xué)習(xí)記憶障礙，即延長(zhǎng)逃避潛伏期 (ECT:F=15.185，P=0.000;MK-801和異丙酚:F=18.591，P=0.000)并縮短空間探索時(shí)間 (ECT:F=9.609，P=0.003;MK-801和異丙酚:F=18.591，P=0.000);兩者的影響相減 (逃避潛伏期:F=112.366，P=0.000;空間探索時(shí)間:F=7.603，P=0.002)(表1、2)。

ECT和異丙酚對(duì)海馬Glu含量的影響 ECT可增加海馬中Glu的濃度 (F=234.540，P=0.000)，異丙酚可減少海馬中Glu的濃度 (F=16.971，P=0.000)，兩者存在相減效應(yīng) (F=11.190，P=0.000)(表3)。

MK-801、異丙酚和ECT對(duì)海馬中Tau蛋白含量的影響 MK-801、異丙酚和ECT對(duì)海馬總Tau蛋白(Tau5蛋白)的表達(dá)無(wú)影響 (ECT:F=0.748，P=0.393;MK-801、異丙酚:F=0.028，P=0.972)，且無(wú)交互效應(yīng) (F=0.145，P=0.865)。ECT可增加海馬中磷酸化Tau蛋白的表達(dá) (pSer396/404:F=40.906，P=0.000;pSer199/202:F=175.859，P=0.000;pSer262:F=49.551，P=0.000)。實(shí)驗(yàn)藥物 (NMDAR拮抗劑和異丙酚)可減少海馬中磷酸化Tau蛋白(pSer396/404:F=52.523，P=0.000;pSer199/202:F=77.013，P=0.000;pSer262:F=77.204，P=0.000)。兩者的影響相減 (pSer396/404:F=4.294，P=0.020;pSer199/202:F=15.730，P=0.000;pSer262:F=9.989，P=0.000)(表4～7)。

表1 Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶成績(jī):逃避潛伏期 (n=8，± s，s)Tablet 1 Morris water maze test:evasive latency time(n=8，± s，s)

表1 Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶成績(jī):逃避潛伏期 (n=8，± s，s)Tablet 1 Morris water maze test:evasive latency time(n=8，± s，s)

ECT:電休克;MK-801:地卓西平馬來(lái)酸鹽;a:主效應(yīng);b:交互效應(yīng)ECT:electroconvulsive therapy;MK-801:dizocilpine maleate;a:main effect;b:crossover effect

分組G r o u p 生理鹽水S a l i n e M K-8 0 1 異丙酚P r o p o f o l 總和S u m FP無(wú)處置N o i n t e r v e n t i o n 3 6.9 3± 4.9 1 6 0.5 8±6.5 5 6 1.0 8±7.5 2 5 2.8 6±1 3.0 4 3 6.9 9 2 0.0 0 0 E C T 9 0.9 3±1 1.1 2 4 9.0 3±6.3 0 4 6.9 5±5.0 6 6 2.3 0±2 2.0 4 7 8.1 8 2 0.0 0 0總和S u m 6 3.9 3±2 9.1 0 5 4.8 1±8.6 1 5 4.0 1±9.5 7 5 7.5 8±1 8.5 4 1 8.5 9 1 a 0.0 0 0 a F 1 5 7.7 8 8 1 2.9 1 4 1 9.4 6 1 1 5.1 8 5 P a 0.0 0 0 0.0 0 3 0.0 0 1 0.0 0 0 a (F=7.6 0 3，P=0.0 0 2)b

表2 Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶成績(jī):空間探索時(shí)間 (n=8，± s，s)Tablet 2 Morris water maze test:space exploration time(n=8，± s，s)

表2 Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶成績(jī):空間探索時(shí)間 (n=8，± s，s)Tablet 2 Morris water maze test:space exploration time(n=8，± s，s)

a:主效應(yīng);b:交互效應(yīng)a:main effect;b:crossover effect

分組G r o u p 生理鹽水S a l i n e M K-8 0 1 異丙酚P r o p o f o l 總和S u m FP無(wú)處置N o i n t e r v e n t i o n 3 0.1 4± 4.8 2 1 1.8 4±1.7 8 1 2.3 9±1.3 0 1 8.1 3±9.1 6 9 2.4 5 6 0.0 0 0 E C T 1 1.2 1± 2.3 4 1 7.4 3±1.8 5 1 8.7 5±1.9 3 1 5.8 0±3.8 9 3 0.8 4 6 0.0 0 0總和 S u m 2 0.6 8±1 0.4 4 1 4.6 4±3.3 8 1 5.5 7±3.6 5 1 6.9 6±7.0 6 2 4.9 2 6 a 0.0 0 0 a F 9 9.8 2 8 3 7.7 7 3 5 9.7 6 1 9.6 0 9 P a 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 3 a (F=1 2 1.8 6 9，P=0.0 0 0)b

表3 海馬中Glu的含量 (n=8，± s，μmol/g蛋白)Tablet 3 Glutamate level in the hippocampus of rats(n=8，± s，μmol/g protein)

表3 海馬中Glu的含量 (n=8，± s，μmol/g蛋白)Tablet 3 Glutamate level in the hippocampus of rats(n=8，± s，μmol/g protein)

a:主效應(yīng);b:交互效應(yīng)a:main effect;b:crossover effect

分組G r o u p 生理鹽水S a l i n e M K-8 0 1 異丙酚P r o p o f o l 總和S u m FP無(wú)處置N o i n t e r v e n t i o n 4 9.0 6± 9.4 7 5 2.6 2±1 0.5 0 4 3.3 0± 8.5 5 4 8.3 3± 9.9 2 1.9 4 6 0.1 6 8 E C T 1 6 8.6 6±3 3.1 1 1 5 7.6 7±3 0.3 1 9 6.3 0±1 8.4 8 1 4 0.8 8±4 2.1 3 1 5.4 8 7 0.0 0 0總和S u m 1 0 8.8 6±6 6.0 9 1 0 5.1 4±5 8.5 0 6 9.8 0±3 0.7 0 9 4.6 0±5 5.7 1 1 6.9 7 1 a 0.0 0 0 a F 9 6.4 8 0 8 5.8 1 9 5 4.1 9 2 2 3 4.5 4 0 P a 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0 a (F=1 1.1 9 0，P=0.0 0 0)b

討 論

ECT后認(rèn)知障礙與Glu受體過(guò)度激動(dòng)引起氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)飽和，造成突觸可塑性障礙有關(guān)［10］。本研究觀察到ECT后Glu在神經(jīng)元中濃度明顯升高，與Wu等［4］研究結(jié)果一致。

表4 海馬中Tau蛋白總含量 (n=8，± s，積分吸光度值)Tablet 4 Tau5 protein level in the hippocampus of rats(n=8，± s，integral absorbance value)

表4 海馬中Tau蛋白總含量 (n=8，± s，積分吸光度值)Tablet 4 Tau5 protein level in the hippocampus of rats(n=8，± s，integral absorbance value)

a:主效應(yīng);b:交互效應(yīng)a:main effect;b:crossover effect

分組Group 生理鹽水Saline MK-801 異丙酚Propofol 總和Sum FP無(wú)處置No intervention 1360.88±248.60 1401.13±209.90 1385.63±189.89 1382.54±208.52 0.070 0.933 ECT 1472.50±288.65 1437.38±296.39 1415.88±162.57 1441.92±246.39 0.099 0.906總和 Sum 1416.69±266.55 1419.25±248.81 1400.75±171.48 1412.23±227.78 0.028a 0.972a F 0.687 0.080 0.117 0.748 P a 0.421 0.782 0.737 0.393a (F=0.145，P=0.865)b

表5 海馬中pSer396/404的含量 (n=8，± s，積分吸光度值)Tablet 5 pSer396/404level in the hippocampus of rats(n=8，± s，integral absorbance value)

表5 海馬中pSer396/404的含量 (n=8，± s，積分吸光度值)Tablet 5 pSer396/404level in the hippocampus of rats(n=8，± s，integral absorbance value)

a:主效應(yīng);b:交互效應(yīng)a:main effect;b:crossover effect

分組Group 生理鹽水Saline MK-801 異丙酚Propofol 總和SumFP無(wú)處置No intervention 229.88±51.52 151.50±28.51 149.88±28.09 177.08±52.44 11.788 0.000 ECT 337.38±42.69 197.00±28.70 192.63±24.31 242.33±75.51 50.263 0.000總和 Sum 283.63±71.91 174.25±36.27 171.25±33.64 209.71±72.27 52.523a 0.000a F 20.648 10.122 10.594 40.906 P a 0.000 0.007 0.006 0.000a (F=4.294，P=0.020)b

表6 在海馬中pSer199/202含量 (n=8，± s，積分吸光度值)Tablet 6 pSer199/202level in the hippocampus of rats(n=8，± s，integral absorbance value)

表6 在海馬中pSer199/202含量 (n=8，± s，積分吸光度值)Tablet 6 pSer199/202level in the hippocampus of rats(n=8，± s，integral absorbance value)

a:主效應(yīng);b:交互效應(yīng)a:main effect;b:crossover effect

分組Group 生理鹽水Saline MK-801 異丙酚Propofol 總和SumFP無(wú)處置No intervention 326.63±51.60 150.38±33.87 146.38±26.24 207.79±93.48 56.533 0.000 ECT 854.00±180.94 388.13± 64.42 375.50± 50.82 539.21±252.47 45.214 0.000總和Sum 590.31±301.14 269.25±132.46 260.94±124.60 373.50±252.02 77.013a 0.000a F 62.852 85.365 128.370 175.859 P a 0.000 0.000 0.000 0.000a (F=15.730，P=0.000)b

表7 海馬中pSer262含量 (n=8，± s，積分吸光度值)Tablet 7 pSer262level in the hippocampus of rats(n=8，± s，integral absorbance value)

表7 海馬中pSer262含量 (n=8，± s，積分吸光度值)Tablet 7 pSer262level in the hippocampus of rats(n=8，± s，integral absorbance value)

a:主效應(yīng);b:交互效應(yīng)a:main effect;b:crossover effect

分組Group 生理鹽水Saline MK-801 異丙酚Propofol 總和SumFP無(wú)處置No intervention 168.88±22.07 94.63±17.64 98.50±19.64 120.67±39.69 35.405 0.000 ECT 283.38±56.93 128.88±21.11 130.75±20.45 181.88±81.96 45.960 0.000總和 Sum 226.13±72.36 111.75±25.81 114.63±25.54 150.83±70.63 77.204a 0.000a F 28.128 12.402 10.350 49.551 P a 0.000 0.003 0.006 0.000a (F=9.989，P=0.000)b

本研究結(jié)果顯示，ECT后海馬Glu濃度明顯上升同時(shí)伴有認(rèn)知能力減退，而使用NMDAR拮抗劑后，Glu受體過(guò)度激動(dòng)造成的學(xué)習(xí)記憶障礙緩解，該結(jié)果與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果［10］相同。異丙酚可降低ECT后海馬中的Glu，亦可改善ECT后的學(xué)習(xí)記憶，與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果［1，10］亦相同，且NMDAR拮抗劑MK-801與異丙酚改善ECT后認(rèn)知功能的效果類似。

本研究還發(fā)現(xiàn)，異丙酚和MK-801保護(hù)ECT后學(xué)習(xí)記憶過(guò)程與減輕海馬中Tau蛋白過(guò)度磷酸化程度有關(guān)，總Tau蛋白的表達(dá)在ECT應(yīng)激前后沒(méi)有明顯變化，而Ser199/202位點(diǎn)磷酸化程度與ECT應(yīng)激關(guān)系緊密，推測(cè)這可能與Ser199/202位于微管結(jié)合區(qū)，其磷酸化參與調(diào)節(jié)Tau蛋白與微管的結(jié)合活性［14］有關(guān)。

NMDAR激動(dòng)可以增加Tau磷酸化程度，從而損傷神經(jīng)元［15］;而NMDAR可阻斷Glu的興奮性毒性，使經(jīng)由Tau蛋白過(guò)度磷酸化程度而造成的神經(jīng)損傷過(guò)程中斷。故可推測(cè)ECT作為強(qiáng)應(yīng)激導(dǎo)致海馬Glu濃度升高，而Glu激動(dòng)離子型受體通過(guò)引發(fā)興奮性毒性增加海馬Tau蛋白磷酸化程度，最終影響降低軸突轉(zhuǎn)運(yùn)效率，神經(jīng)信號(hào)傳遞障礙及突觸退化，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙。其中，海馬Tau蛋白過(guò)磷酸化后會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸障礙，可進(jìn)一步造成Glu在受損神經(jīng)元的積聚，形成惡性循環(huán)，加重神經(jīng)元損傷程度。如研究結(jié)果所示，若阻斷其中某一環(huán)節(jié)(如使用異丙酚降低腦內(nèi)Glu或使用NMDAR拮抗劑)，則ECT等應(yīng)激所致海馬Tau蛋白過(guò)磷酸化程度會(huì)明顯減緩，同時(shí)學(xué)習(xí)記憶障礙會(huì)相應(yīng)緩解。

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Effects of Propofol and Dizocilpine Maleate on the Cognitive Abilities and the Hyperphosphorylation of Tau Protein of Rats after the Electroconvulsive Therapy

LIU Chao1，MIN Su1，WEI Ke1，LIU Dong2，DONG Jun1，LUO Jie1，LI Ping，LIU Xiao-Bin1

1Department of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China
2Department of Neurosurgery，the Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China

MIN Su Tel:023-89011068，E-mail:minsu89011068@yahoo.com.cn

ObjectiveTo explore the effects of propofol and dizocilpine maleate(MK-801)on the cognitive abilities the hyperphosphorylation of Tau protein of rats after the electroconvulsive therapy.Methods

Two intervention factors including electroconvulsive shock therapy(ECT)(two levels:not applied and one treatment course)and drug intervention(three levels:intravenous saline，intravenous MK-801，and intravenous propofol).The morris water maze test started within 1 day after ECT to evaluate the learning-memory.Theglutamate level in the hippocampus of rats was determined by high-performance liquid chromatography.The Tau protein that includes Tau5(total Tau protein)，PHF-1(pSer396/404)，AT8(pSer199/202)，and 12E8(pSer262)in the hippocampus of rats was determined using Western blotting.ResultsPropofol，MK-801，and ECT could induce the impairment of learning-memory in depressed rats.The electroconvulsive shock significantly upregulated the glutamate level，which was reduces by the propofol.The ECT up-regulated the hyperphosphorylation of Tau protein in the hippocampus of depressed rats，which was reduced by propofol and MK-801.ConclusionBoth propofol and MK-801 could protect against the impairment of learning-memory and reduce the hyperphosphorylation of Tau protein induced by ECT in depressed rats.

propofol;N-methyl-d-aspartate receptor antagonist;electroconvulsive therapy;learning and memory;Tau protein

Acta Acad Med Sin，2012，34(4):324-329

閔 蘇 電話:023-89011068，電子郵件:minsu89011068@yahoo.com.cn

R614.2+4

A

1000-503X(2012)04-0324-06

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.04.003

國(guó)家自然科學(xué)基金 (30972831)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(30972831)

2011-12-16)

·綜 述·