纖維素硫酸鈉的制備及性能測定

朱麗英，姚善涇

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江 杭州 310027）

纖維素硫酸鈉的制備及性能測定

朱麗英，姚善涇

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江 杭州 310027）

采用凝膠滲透色譜法、BaSO4比濁法和酶降解法分別測纖維素硫酸鈉（NaCS）的分子量、取代度和降解性，并考察了NaCS制備條件對NaCS性質(zhì)影響。結(jié)果表明：制備NaCS的反應(yīng)時間越長，NaCS的分子量越?。环肿恿糠植枷禂?shù)先逐漸增加，在6 h達(dá)到最大值（5.16），繼續(xù)反應(yīng)，分子量分布系數(shù)迅速下降；NaCS的取代度隨著反應(yīng)時間延長先逐漸增大，到6 h后，取代度保持在0.5左右；NaCS的降解性隨著其取代度增加而呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。

纖維素硫酸鈉 凝膠滲透層析 硫酸鋇比濁法 取代度 分子量分布 生物降解

纖維素硫酸鈉（NaCS）是一種由纖維素經(jīng)磺化而成的衍生物，常與聚二甲基二烯丙基氯化（PDMDAAC）、殼聚糖等陽離子聚合物結(jié)合形成微膠囊或復(fù)合物，以前主要用于細(xì)胞或酶的固定化[1-3]，近來以醫(yī)藥方面的應(yīng)用為主[4-6]。Wang等[6]以NaCS和殼聚糖為主要原料制備膠囊，將其用于結(jié)腸靶向給藥，發(fā)現(xiàn)該膠囊具有良好的結(jié)腸靶向性，有望成為一種新型的結(jié)腸靶向給藥載體；Xie等[7,8]將NaCS分別與殼聚糖和PDMDAAC采用層層自組裝方法制備成微米級膠囊，為NaCS的應(yīng)用提供了新的思路。雖然自上世紀(jì)90年代就有人開展了NaCS的制備與應(yīng)用的研究，但至今仍未有商品問世，其中最大的阻礙是NaCS性能的標(biāo)定問題。盡管已有不少研究者報道了NaCS制備工藝對NaCS得率、取代度和微膠囊性能的影響[9-11]，但所采用的方法的準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步考證。關(guān)于NaCS分子量測定的報道非常少，王明君[12]曾采用光散射法（LS）測NaCS分子量，但該方法只能測一種分子量，而不能考察分子量分布情況，而凝膠滲透色譜法（GPC）能夠同時測重均分子量（Mw），數(shù)均分子量（Mn）及分子量分布。BaSO4比濁法[13]是利用BaCl2與從糖復(fù)合物中釋放的硫酸基結(jié)合，生成硫酸鋇，而后用分光光度計測定其濁度，該方法操作簡單，測定結(jié)果穩(wěn)定可靠，常用來定量測定糖復(fù)合物中的硫酸基團(tuán)。與聚電解質(zhì)滴定法相比，BaSO4比濁法更能準(zhǔn)確地測定出NaCS的取代度。要作為結(jié)腸靶向給藥材料，NaCS需要生物可降解，由于結(jié)腸中存有大量的纖維素分解細(xì)菌[14]，所以有必要了解NaCS被纖維素酶降解的性能，從而可以了解NaCS作為結(jié)腸靶向給藥系統(tǒng)材料的可能性。因此，本工作采用凝膠滲透色譜法（GPC）測NaCS分子量，用BaSO4比濁法測NaCS的取代度，用酶降解法測NaCS的降解性能，并在此基礎(chǔ)上，探討制備條件對NaCS分子量的影響，以期為標(biāo)定NaCS性能提供較為可靠的方法，為制備品質(zhì)優(yōu)良的NaCS提供參考。

1 實驗部分

1.1 NaCS制備

NaCS按照文獻(xiàn)[10]方法制備。纖維素購自海鹽長川壩精制棉有限公司，其聚合度分別為1 491，1 780，2 137和2 230。濃硫酸、異丙醇和正丙醇均為市售分析純，95%乙醇為工業(yè)級。綠色木霉纖維素酶由國藥化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 分析方法

采用GPC測分子量。GPC檢測條件：PL auagel-OH 50（300 mm × 7.5 mm），PL auagel-OH 40（300 mm× 7.5 mm）和PL auagel-OH 20（300 mm × 7.5 mm） 三柱串聯(lián)，凝膠孔徑分別為8和5 μm，排阻分子量為0.1～1 000 kDa；Empower色譜工作站；流動相為含0.1 mol/L硝酸鈉的蒸餾水，流速為0.8 mL/min；柱溫為30 ℃；標(biāo)準(zhǔn)樣品為葡聚糖。

采用BaSO4比濁法測取代度。稱取適量樣品放入盛有1 mL 濃度為1 mol/L HCl的試管中，密封，于100 ℃水解6 h，冷卻后開啟試管。內(nèi)容物減壓旋轉(zhuǎn)蒸干，殘渣用1 mL蒸餾水溶解。取水解液0.1 mL，放入檢測試管中，加蒸餾水至0.4 mL，再加入三氯乙酸0.35 mL和氯化鋇明膠溶液0.25 mL，混合。K2SO4標(biāo)準(zhǔn)品和水空白也按此操作。混合液在360 nm下測吸光度。最后參照K2SO4標(biāo)準(zhǔn)曲線計算SO42-濃度。NaCS的取代度按公式（1）計算。

式中，MS和MC分別代表NaCS中硫元素和碳元素的含量。NaCS的取代度指每個葡萄糖分子所含的磺酸基團(tuán)量。

纖維素酶降解性能的測定：將適量NaCS溶于20 mL pH值為6.8 的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中，加入80 IU/L 纖維素酶，在37 ℃，100 r/min的條件下降解30 min。然后，沸水浴5 min將纖維素酶滅活，離心去除酶沉淀后，采用乙醇將降解液中的NaCS沉淀出來，離心去除上清液，于60 ℃真空干燥，然后計算NaCS的降解率。

2 結(jié)果與討論

2.1 NaCS分子量的測定以及纖維素聚合度和反應(yīng)時間的影響

制備 NaCS的主反應(yīng)是將纖維素與硫酸-正丙醇溶液在低溫下進(jìn)行磺化，其中纖維素聚合度、反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度等都是影響NaCS性質(zhì)的重要參數(shù)。章小忠等[11]曾通過正交設(shè)計法對NaCS的制備條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)-6 ℃是NaCS制備的最佳溫度，因此，本工作在-6 ℃下制備了 NaCS，并重點考察了纖維素聚合度和反應(yīng)時間對其分子量的影響，結(jié)果分別列于表1和表2中。

表1 纖維素聚合度對NaCS分子量的影響Table 1 Effect of polymerization degree of cellulose on molecular weight of NaCS

表2 NaCS分子量隨反應(yīng)時間的變化Table 2 Change of molecular weight of NaCS with reaction time

表1中的結(jié)果表明，采用光散射法和凝膠滲透色譜法測得的分子量變化較一致，但采用光散射法測得的分子量比后者所得結(jié)果小。由表1還可以看出，隨著纖維素聚合度的增大，NaCS分子量逐漸增加，分散系數(shù)逐漸減小。由表2可知，隨著反應(yīng)時間的延長，無論是NaCS的重均分子量、還是數(shù)均分子量和黏均分子量都越來越小，而NaCS分子量分散系數(shù)的變化與其分子量的變化并不一致，當(dāng)將反應(yīng)時間從2 h增加到6 h時，NaCS分散度顯著提高，而繼續(xù)延長反應(yīng)時間，分散度逐漸趨于1。

2.2 NaCS取代度測定方法比較以及纖維素聚合度和反應(yīng)時間的影響

以BaSO4比濁法考察了纖維素的聚合度和反應(yīng)時間對NaCS取代度的影響，結(jié)果分別見圖1和圖2。由圖1可以看出，隨著纖維素聚合度的增大，NaCS取代度逐漸減小。由圖2可知，反應(yīng)6 h之前，反應(yīng)時間的延長會導(dǎo)致NaCS取代度增大，但繼續(xù)延長反應(yīng)時間對NaCS取代度的影響不大。與聚電解質(zhì)滴定法結(jié)果[14]相比，采用 BaSO4比濁法測得的取代度數(shù)值略低。為比較兩方法的準(zhǔn)確性，本研究采用元素分析法對兩個NaCS樣品進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。由表3可見，BaSO4比濁法所測得的取代度與元素分析結(jié)果基本一致?？梢?，BaSO4比濁法可以替代聚電解質(zhì)滴定法。BaSO4比濁法比聚電解質(zhì)滴定法能更準(zhǔn)確地測NaCS的取代度，而其成本卻遠(yuǎn)小于采用元素分析法所需的成本。

圖1 纖維素聚合度對NaCS取代度的影響Fig.1 Effect of polymerization degree of cellulose on substitution degree of NaCS

圖2 NaCS取代度隨反應(yīng)時間的變化Fig.2 Change of substitution degree of NaCS with reaction time

表3 不同方法測定NaCS取代度的比較Table 3 Comparison of substitution degree of NaCS determined by different methods

2.3 NaCS被纖維素酶降解性能

纖維素聚合度和取代度對纖維素酶降解NaCS的影響見圖3。由圖3可知，隨著纖維素聚合度的增大，NaCS降解率逐漸增大。當(dāng)纖維素聚合度由2 137上升到2 230時，NaCS的降解率顯著提高。而圖4顯示，當(dāng)反應(yīng)時間由2 h延長到6 h時，NaCS的降解率顯著下降，但當(dāng)反應(yīng)時間為6～12 h時，NaCS降解率變化不大。結(jié)合前面所述可知，NaCS的取代度對其降解率影響非常大，這可能是因為硫酸基團(tuán)的加入對纖維素酶的接近造成了空間阻礙，從而使取代度高的NaCS降解率較低。

圖3 纖維素聚合度對纖維素酶降解NaCS的影響Fig.3 Effect of polymerization degree of cellulose on degradation of NaCS by cellulose

圖4 反應(yīng)時間對于纖維素酶降解NaCS的影響Fig.4 Degradation of NaCS by cellulose with reaction time

3 結(jié) 論

采用凝膠滲透色譜法、BaSO4比濁法、酶降解法分別測定了NaCS分子量、取代度和降解性能，為標(biāo)定NaCS性能提供了較為準(zhǔn)確的方法。通過比較NaCS的分子量、取代度和纖維素酶降解情況，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時間是影響NaCS分子量及其分散系數(shù)和取代度非常重要的因素，而且NaCS取代度的大小將會直接影響到纖維素酶對NaCS的降解。

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Preparation of Sodium Cellulose Sulfate and Determination of Properties

Zhu Liying, Yao Shanjing
(Department of Biochemical Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)

Gel permeation chromatograph, BaSO4turbidimetry and enzymatic degradation were employed to determine the molecular weight, structure and degradation property of sodium cellulose sulfate (NaCS) and the influence of the preparation conditions on the properties of NaCS were investigsated. The results showed that increasing the reaction time would lead to lower molecular weight. Meanwhile, with the increase of the reaction time, the polydispersity increased and reached the maximum (5.16) at 6 h. However, further increase of reaction time would lead to a sharp decrease of polydispersity. When it came to the substitution degree of NaCS, it increased with the increase of reaction time gradually, and kept about 0.5 after reaction 6 h. In addition, the degradation of NaCS by cellulase decreased with the increase of the substitution degree of NaCS.

sodium cellulose sulfate; gel permeation chromatograph; barium sulfate turbidimetry; substitution degree; molecular weight distribution; enzymatic degradation

TQ352.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

1001—7631 ( 2012 ) 02—0154—05

2011-07-01；

2012-03-14

朱麗英（1982-），女，博士研究生；姚善涇（1957-），男，教授，通訊聯(lián)系人。E-mail: yaosj@zju.edu.cn

國家自然科學(xué)基金項目（20876139，21036005）