腌制莧菜梗的微生物菌群結(jié)構(gòu)及其品質(zhì)

沈錫權(quán)， 趙永威， 吳祖芳＊， 翁佩芳

（1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211）

腌制莧菜梗的微生物菌群結(jié)構(gòu)及其品質(zhì)

沈錫權(quán)1，2， 趙永威1，2， 吳祖芳＊1，2， 翁佩芳1，2

（1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211）

腌制莧菜梗是浙東傳統(tǒng)的特色腌制食品，了解其細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)并探討對(duì)亞硝酸鹽等理化品質(zhì)的影響，以確保腌制食品的安全性。采用16S r DNA基因克隆文庫(kù)的方法，對(duì)腌制成熟的莧菜梗中細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行了分析，共檢測(cè)出了乳桿菌、類(lèi)香菌、弓形桿菌等6個(gè)菌屬，其中乳桿菌屬占優(yōu)勢(shì)為總數(shù)的83.9%。與此同時(shí)，測(cè)定了腌制莧菜梗體系亞硝酸鹽等一些理化指標(biāo)，腌制成熟時(shí)p H值為4.35，鹽度為5.5，亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.99 mg／kg（未超標(biāo)），細(xì)菌和乳酸菌濃度分別為8.8×106CFU／m L和1.6×106CFU／m L。

腌制莧菜梗；16S r DNA克隆文庫(kù)；菌群結(jié)構(gòu)；品質(zhì)

浙東傳統(tǒng)的特色腌制食品以寧波地區(qū)的臭莧菜梗、臭冬瓜和臭芋艿蕻（俗稱(chēng)“三臭”）最為著名，其歷史淵源深遠(yuǎn)，清代范寅在《越諺》中對(duì)莧菜的描寫(xiě)有“其梗如蔗，段之腌之，氣臭味佳，最下飯”；寧海西鄉(xiāng)民間有“無(wú)臭不下飯”的說(shuō)法，可見(jiàn)這類(lèi)食品獨(dú)特的風(fēng)味與具有增進(jìn)食欲的魅力。俗語(yǔ)又說(shuō)：“六月莧，當(dāng)雞蛋，七月莧，金不換”，由此可見(jiàn)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值之高。據(jù)現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)分析，莧菜富含鈣、磷、鐵、胡蘿卜素和多種維生素［1－2］。由于這些食品風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富，是浙江沿海一帶著名的傳統(tǒng)特色腌制食品，深受民眾喜愛(ài)。但是莧菜易富集硝酸鹽，如腌制條件控制不好會(huì)使亞硝酸鹽含量超標(biāo)以及有害菌群的生長(zhǎng)從而危害人體健康［3－4］；而長(zhǎng)期以來(lái)人們對(duì)這類(lèi)傳統(tǒng)腌制菜的食用安全性缺乏深入認(rèn)識(shí)，對(duì)臭莧菜梗的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)更是缺乏了解。目前對(duì)食品的菌相分析常采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)，然后進(jìn)行鑒定的方法，受培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方法等條件的限制，難以客觀準(zhǔn)確地表現(xiàn)出樣品中原有的菌落體系［5－6］。分子生物學(xué)技術(shù)的日益發(fā)展使得微生物多樣性分析的精度和廣度不斷提高，在分子微生態(tài)研究中已體現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值。燕平梅等［7］基于16S rDNA克隆文庫(kù)法研究了發(fā)酵甘藍(lán)鹵水中微生物，得出4種獨(dú)特的菌落，即Lactobacillus acidifarinae、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、融合乳桿菌（Weissella confusa）和足球菌屬的種（Pediococcus sp.），用這種分子方法發(fā)現(xiàn)了常規(guī)分離培養(yǎng)技術(shù)未鑒定的乳酸菌Lactobacillus acidifarinae。Tamara等［8］用 DGGE 法 和16S r DNA克隆文庫(kù)法研究了加納和巴西咖啡豆發(fā)酵過(guò)程中的微生物菌群多樣性，發(fā)現(xiàn)體系中含有許多傳統(tǒng)方法所未培養(yǎng)出的細(xì)菌。作者采用16S r DNA克隆文庫(kù)法，解析腌制莧菜梗微生物菌群結(jié)構(gòu)，并結(jié)合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)亞硝酸鹽等一些理化指標(biāo)、細(xì)菌總數(shù)和乳酸菌總數(shù)進(jìn)行了測(cè)定，為腌制莧菜梗的品質(zhì)控制和食用安全性提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料腌制用莧菜梗：購(gòu)于寧波農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；Fast DNA SPIN Kit試劑盒，擴(kuò)增用PCR體系（10×Buffer、MgCl2、d NTPs、Ex－Taqpolymer－ase）、載體p MD18－T、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞和DNA Marker：購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；DNA回收試劑盒、引物：由生工生物工程（上海）有限公司提供。

1.1.2 儀器pH計(jì)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、梯度PCR儀、Alphalmger 2200凝膠成像系統(tǒng)等。

1.1.3 培養(yǎng)基MRS固體培養(yǎng)基，PCA固體培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基，選擇性LB培養(yǎng)基（Amp＋）按文獻(xiàn)［8］配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 莧菜梗的腌制莧菜梗的腌制按傳統(tǒng)腌制工藝進(jìn)行。將新鮮的莧菜梗清洗干凈后稱(chēng)重。然后切成邊長(zhǎng)6 cm左右的小段，用水浸泡24 h左右，等水起白泡，即把莧菜梗撈起，洗凈并瀝干，然后按照12.5 kg莧菜梗加0.7 kg食鹽的比例加入食鹽。最后用塑料紙封口，放于陰涼處發(fā)酵20 d左右即可，作為菌群分析用樣品。

1.2.2 樣品總DNA提取純化采用Fast DNA SPIN Kit試劑盒，按說(shuō)明書(shū)步驟對(duì)腌制莧菜梗鹵水樣品50 m L進(jìn)行總DNA的提取。

1.2.3 PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增所用的反應(yīng)體系為：10×Buffer 5μL、25 mmol／L的 MgCl25μL、2.5 mmol／L的d NTP 8μL、10μmol／L的上下游引物各1.0μL ，具體為27F（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）和 1492R（5′－TACGGCTACCTTGTTACGACTT－3′）、模板 DNA 1.0μL、5 U／μL的Ex－TaqDNA聚合酶0.4μL，用無(wú)菌dd H2O補(bǔ)足50μL體系。PCR反應(yīng)的循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性3 min，30個(gè)循環(huán)（94℃變性50 s，52℃退火50 s，72℃延伸1 min 30 s），72℃最后延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用純化試劑盒切膠純化。

1.2.4 16S r DNA克隆文庫(kù)的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物純化后與p MD18－T載體在4℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α。用引物M13F和M13R隨機(jī)檢測(cè)出60個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 基因序列的鑒別測(cè)序結(jié)果采用DAMBE、DNAstar、MEGA 4.1等軟件進(jìn)行編輯分析，并把編輯好的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，分析出克隆所屬物種的系統(tǒng)位置和與之最近似的種類(lèi)。

1.2.6 分析方法鹽度、p H值和亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：取莧菜梗的腌制鹵水，按文獻(xiàn)［9］進(jìn)行測(cè)定；細(xì)菌總數(shù)以及乳酸菌總數(shù)變化情況的測(cè)定：取莧菜梗的腌制鹵水，利用稀釋倒平板法測(cè)定鹵水中細(xì)菌總數(shù)以及乳酸菌總數(shù)的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌16S r DNA克隆文庫(kù)的構(gòu)建

將來(lái)自腌制莧菜梗樣品的58個(gè)陽(yáng)性克隆子的測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，克隆子與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知細(xì)菌的16S rDNA序列相似性均在95%以上，檢測(cè)出樣品共含有6個(gè)菌屬，見(jiàn)圖1。即乳桿菌屬（Lactobacillus）、類(lèi)香菌屬（Myroides）、弓形桿菌屬（Arcobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）、片球菌屬（Pediococcus）和產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes），其中乳桿菌屬有51個(gè)克隆子，占總菌數(shù)的83.9%，其余5個(gè)屬細(xì)菌占16.1%。為方便分析，把差異在0.5%之內(nèi)的序列作為一個(gè)分類(lèi)操作單元（operational taxonomic unit，OTU），樣品可分成15個(gè)OTU，腌制后臭莧菜梗樣品的細(xì)菌群落組成測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 NJ法構(gòu)建腌制莧菜梗中細(xì)菌16S r DNA克隆文庫(kù)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Establishment of phylogenetic tree based on the neighbour－joining analysis of 16S r DNA sequence in fermented amaranth stem

表1 16S r DNA克隆文庫(kù)法對(duì)腌制臭莧菜梗樣品的細(xì)菌群落組成分析結(jié)果Tab.1 Analytical results of bacterial community composition for fermented amaranth stem based on 16S r DNA clone library

續(xù)表1

2.2 鹽度、p H和亞硝酸鹽的測(cè)定

對(duì)腌制莧菜梗樣品的鹽度和p H值進(jìn)行了測(cè)定，分別為5.5%和4.35；亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.99 mg／kg。

2.3 細(xì)菌總數(shù)以及乳酸菌總數(shù)的測(cè)定

對(duì)腌制莧菜梗樣品的細(xì)菌總數(shù)和乳酸菌總數(shù)進(jìn)行測(cè)定，分別為8.8×106CFU／m L和1.6×106CFU／m L。

3 結(jié)語(yǔ)

采用16S r DNA基因克隆文庫(kù)方法較好地反映了腌制成熟的莧菜梗樣品細(xì)菌的多樣性，從組成菌屬組成可以看出，菌群結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，樣品共含有6個(gè)菌屬，其中乳桿菌屬占總菌數(shù)高達(dá)83.9%，其余5個(gè)屬細(xì)菌占16.1%。在對(duì)樣品分成的15個(gè)分類(lèi)操作單元（OTU）中，乳桿菌屬可分為9個(gè)OTU，其中A1型數(shù)量最多共38個(gè)克隆子（占樣品總數(shù)65.5%），在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)分析，與Lactobacillus casei（干酪乳桿菌）（登錄號(hào)：AB690233）最相似，相似性在99.5%～100%，干酪乳桿菌在乳酸菌種類(lèi)中組成重要地位，屬于益生菌，因此，食用腌制莧菜梗對(duì)于改善人體腸道微生物組成結(jié)構(gòu)是有益的。

硝酸鹽和亞硝酸鹽是食品加工的常用的添加劑，能使產(chǎn)品呈現(xiàn)良好色澤、防腐以及增強(qiáng)風(fēng)味的作用［10－11］；但亞硝酸鹽具有危害性，可使血液中低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，使得血紅蛋白的攜氧能力下降，引起組織缺氧，并對(duì)周?chē)苡袛U(kuò)張作用；亞硝酸鹽還可以與食物或胃中的仲胺類(lèi)物質(zhì)作用轉(zhuǎn)化為亞硝胺，可引起食管癌、胃癌、肝癌和大腸癌等［14］，是強(qiáng)致癌物質(zhì)之一；因此，亞硝酸鹽作為腌制菜食用安全最重要的控制指標(biāo)之一。在蔬菜加工中亞硝酸鹽的主要來(lái)源途徑之一是硝酸鹽被某些細(xì)菌還原生成。張加春等［12］對(duì)大白鼠舌表硝酸鹽還原菌進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示腸桿菌科、葡萄球菌屬、莫拉氏菌屬和奈瑟氏球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌，因此，控制這些細(xì)菌種類(lèi)對(duì)于含硝酸鹽較高的食品物料中亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的減少具有重要作用。先期在對(duì)蔬菜腌制過(guò)程菌群組成及其動(dòng)態(tài)變化研究結(jié)果表明，蔬菜中腸桿菌科細(xì)菌分布較多；另外，有文獻(xiàn)報(bào)道一些乳酸菌種屬能夠降解亞硝酸鹽，一方面通過(guò)產(chǎn)生酶蛋白來(lái)降解，另一方面乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸降低環(huán)境中的p H也能使亞硝酸鹽得到降解［13］；因此，要使腌制蔬菜產(chǎn)品中亞硝酸鹽處于較低水平，關(guān)鍵在于如何讓乳酸菌占優(yōu)勢(shì)而抑制腸桿菌科細(xì)菌生長(zhǎng)。從腌制成熟莧菜梗細(xì)菌組成多樣性分析結(jié)果可以看出，腌制成熟后乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌，比例高達(dá)83.9%，這對(duì)腌制樣品亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的控制起到了關(guān)鍵的作用。

另一方面，腌制覓菜梗的亞硝酸鹽含量與腌制時(shí)間、腌制方法和溫度有關(guān)［3］，這種變化實(shí)際上由微生物組成種群變化有關(guān)。腌制時(shí)間初期亞硝酸鹽含量增高，腌制7～8 d時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，隨后逐漸下降；而亞酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨腌制的溫度升高而增加。先期在研究榨菜、雪菜及冬瓜低鹽腌研究中發(fā)現(xiàn)，腌制初期腸桿菌科細(xì)菌較多，亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷升高，當(dāng)乳酸菌數(shù)量占優(yōu)勢(shì)時(shí)亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷下降；而傳統(tǒng)的高鹽濃度腌制工藝，其食鹽質(zhì)量濃度達(dá)12 g／d L以上時(shí)，亞硝酸鹽產(chǎn)生受到抑制，這些條件都在于調(diào)控腸桿菌科細(xì)菌和乳酸菌的生長(zhǎng)情況，因此，高鹽、密封和添加發(fā)酵劑等操作方式均能有效控制亞硝酸鹽的形成。為安全起見(jiàn)，采用傳統(tǒng)的覓菜梗腌制方法，需經(jīng)10 d以上方可食用［14］。由本研究樣品的p H值和亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析結(jié)果，腌制莧菜梗樣品低p H以及乳桿菌屬細(xì)菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，抑制了腸桿菌科細(xì)菌的生存和生長(zhǎng)，使得雖然低鹽體系但亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)未超標(biāo)。

4 結(jié)論

1）16S r DNA基因克隆文庫(kù)法測(cè)定腌制莧菜梗樣品的菌群結(jié)構(gòu)，共檢測(cè)出6個(gè)菌屬，即乳桿菌屬（Lactobacillus）、類(lèi)香菌屬（Myroides）、弓形桿菌屬（Arcobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）、片球菌屬（Pediococcus）和產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes），其中乳桿菌屬有51個(gè)克隆子，占總菌數(shù)的83.9%，其余5個(gè)屬細(xì)菌占16.1%。

2）腌制莧菜梗樣品的鹽度和p H值為5.5%和4.35，亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.99 mg／kg，未超標(biāo)。

3）腌制莧菜梗樣品的細(xì)菌和乳酸菌含量分別為8.8×106CFU／m L和1.6×106CFU／m L。

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A Preliminary Study of Microbial Community Structure and Its Quality of Pickled Amaranth Stem

SHEN Xi－quan1，2，ZHAO Yong－wei1，2，WU Zu－fang＊1，2，WENG Pei－fang1，2

（1.School of Marine Science，Ningbo University，Ningbo 315211，China；2.Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology，Ministry of Education，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

Fermented amaranth stem is a special traditional characteristics pickled food in east Zhejiang provice，and it is necessary to understand the microbial community structure and influence on physical and chemical properties such as nitrite concentration of fermented amaranth stem to ensure food safety.The bacterial community diversity of fermented amaranth stem was investigated based on the method of 16S rDNA clone library.The results indicated that 6 bacterial communities in sample were detected includingMyroides，ArcobacterandLactobacillus，etc.The predominant community was identified asLactobacillus，which account for 83.9%in total 16S rDNA sequences.In the mean time，the pH value，salinity and nitrite concentration of pickled product of amaranth stem were also detected，they are 4.35，5.5%and 3.99 mg／kg，respectively.The population of bacteria and lactic acid bacteria were 8.8×106CFU／mL and 1.6×106CFU／m L，respectively.These data are within national standard.The research results can provide microbial and theory identification for process parameters of fermented amaranth stem.

fermented amaranth stem，16S r DNA colone library，microbial community structure，characters

＊通信作者：吳祖芳（1963－），男，浙江奉化人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品生物工程技術(shù)方面的研究。E－mail：wuzufang06＠yahoo.com.cn

TS 205

A

1673－1689（2012）05－0486－06

2012－01－05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171735，31071582）；寧波市農(nóng)業(yè)擇優(yōu)委托項(xiàng)目（2010C10017）。

沈錫權(quán)（1980－ ），男，浙江奉化人，食品生物技術(shù)博士研究生。E－mail：shenxiquan＠nbu.edu.cn