釀酒酵母抗氧化相關(guān)基因突變體對黃曲霉毒素B1的清除作用

史 鋒， 黃宇嘯， 李永富

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫 214122）

釀酒酵母抗氧化相關(guān)基因突變體對黃曲霉毒素B1的清除作用

史 鋒1， 黃宇嘯1， 李永富＊2

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫 214122）

黃曲霉毒素（AF）是糧食作物和飼料原料中容易污染的一種強毒性和強致癌性物質(zhì)，釀酒酵母具有毒素清除功能。利用HPLC分析了釀酒酵母野生菌BY4742及三株關(guān)鍵的抗氧化相關(guān)基因缺失菌zwf1Δ、sod2Δ、glr1Δ對黃曲霉毒素B1的清除能力。結(jié)果表明，在PBS緩沖液中存活和死亡的細(xì)胞對AFB1的清除率分別為74%～76%和71%～73%，說明酵母細(xì)胞對AFB1的清除以生物吸附作用為主。在培養(yǎng)基中，3種突變菌活細(xì)胞對AFB1的清除率發(fā)生不同程度的降低，其中g(shù)lr1Δ的AFB1清除能力下降最明顯，其次是sod2Δ，而zwf1Δ下降最少，說明這些關(guān)鍵的抗氧化基因的缺失會影響細(xì)胞在生長狀態(tài)下對AFB1的清除作用。

黃曲霉毒素；釀酒酵母；抗氧化基因；生物脫毒

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是黃曲霉菌（Aspergillus flavus）、寄生曲霉菌（A.parasiticus）等在適宜的溫度、濕度及氧氣條件下產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物［1］，廣泛存在于污染的糧食作物和飼料原料中，尤以霉變的花生、玉米及谷類含量最多。AF的污染是全球性的，在發(fā)展中國家尤為嚴(yán)重［2］。1993年AF被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構(gòu)劃定為I類致癌物，是目前認(rèn)為的毒性和致癌性最強的天然毒素之一，在食品中的最高限量被規(guī)定為30μg／kg。AF具有致癌、致突變、致畸和免疫抑制作用，并兼具急性毒性和慢性毒性，尤會引發(fā)肝癌，因此對全民的健康危害很大。更為嚴(yán)重的是，AF的耐熱性很強，100℃加熱20 h也不被全部破壞，280℃高溫下才會裂解，通常的烹調(diào)條件不能對其產(chǎn)生破壞。AF有多種結(jié)構(gòu)形式，包括 AFB1、AFB2、AFGl、AFG2、AFM1、AFM2等，其中 AFB1是毒性最強、也是食品中污染最多的AF。

由于AF的污染情況越來越令人擔(dān)憂，因此迫切需要尋找有效的方法來控制和去除AF。這可以通過提高谷物的質(zhì)量和儲存狀況來達到，也可以用各種吸附劑改變毒素在人體中的可得性［3］，即通過防霉變、去毒素兩方面來完成對AF的控制和清除。防霉變主要包括選育抗霉菌的優(yōu)良品種生產(chǎn)農(nóng)作物，控制霉菌生長所需的濕度、溫度及氧氣等條件，以及利用霉菌吸附劑或化學(xué)防霉劑防止霉菌污染等。去毒素主要包括利用化學(xué)或生物方法對AF進行體外體內(nèi)吸附或轉(zhuǎn)化，如多孔性真菌毒素吸附劑、益生菌或其結(jié)構(gòu)成分、腐殖酸、葉綠酸等；或通過干預(yù)人體內(nèi)的毒素代謝酶來調(diào)節(jié)毒素在體內(nèi)的代謝活化與解毒過程。

在這些方法中，采用益生菌如乳酸菌、雙歧桿菌、釀酒酵母等對AF進行生物吸附或轉(zhuǎn)化具有獨特的優(yōu)勢。益生菌不僅可以在體外清除AF，還可能在動物細(xì)胞內(nèi)或動物體內(nèi)清除AF［4－5］。益生菌結(jié)合AFB1后對腸粘液的結(jié)合力下降，從而可攜帶AFB1從腸道解離，并最終排出體外。釀酒酵母是重要的工業(yè)發(fā)酵微生物，在工業(yè)釀造產(chǎn)品如葡萄酒中，它能去除微量的生物毒素，如赫曲霉毒素A的污染［6］。釀酒酵母還能減少AFB1對小鼠的毒性，并顯示出對污染玉米中AFB1的強效吸附能力［7］。有研究表明，釀酒酵母的壓力感應(yīng)基因被破壞后，對真菌毒素變得敏感［8］。由于氧化壓力是釀酒酵母面臨的主要壓力之一，釀酒酵母擁有一套由多種還原劑和多種酶、蛋白質(zhì)組成的氧化壓力反應(yīng)系統(tǒng)，為了了解這個系統(tǒng)在毒素清除中的作用，分析了釀酒酵母野生菌BY4742與3株關(guān)鍵的抗氧化基因缺失菌在不同存活狀態(tài)下對AFB1的清除能力。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：質(zhì)量濃度為1 g／d L的酵母抽提物，2 g／d L胰蛋白胨，2 g／d L葡萄糖，p H 值5.0，需要時添加0.2 mg／m L G418。固體培養(yǎng)基中加入2 g／d L瓊脂。

1.2 釀酒酵母菌株

研究所用釀酒酵母菌株均來自于EUROSCARF。突變菌zwf1Δ、sod2Δ、glr1Δ是在野生菌BY4742的基礎(chǔ)上，分別以kanMX4置換ZWF1、SOD2或GLR1基因而構(gòu)建出的基因缺失體。

1.3 酵母細(xì)胞對AFB1的結(jié)合能力測試

2 mg／m L AFB1儲液：將1 mg AFB1（Sigma）分散 于 0.5 m L 苯－乙 腈 （97∶3）中；2μg／m L AFB1－PBS溶液：將2 mg／m L AFB1儲液用 pH 7.3，0.1 mol／L PBS緩沖液稀釋1 000倍；2μg／m L AFB1－YPD培養(yǎng)基：將2 mg／m L AFB1儲液用YPD培養(yǎng)基稀釋1 000倍。

各種酵母細(xì)胞在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期中末期，收集1×108個細(xì)胞，用無菌水洗后，分散于1.0 m L 2 μg／m L AFB1－PBS 溶 液 或 2 μg／m L AFB1－YPD培養(yǎng)基中，30℃靜置保溫一定時間，收集上清，用于測定未被活細(xì)胞結(jié)合的AFB1含量。細(xì)胞沉淀分散于PBS中，振搖保溫，收集上清，用于測定活細(xì)胞結(jié)合的AFB1含量。

另外，在收集了1×108個細(xì)胞并洗后，1×105Pa滅菌30 min，將細(xì)胞分散于1.0 m L 2μg／m L AFB1－PBS溶液中，30℃靜置保溫一定時間，測定未被死細(xì)胞結(jié)合和死細(xì)胞結(jié)合的AFB1含量。

1.4 AFB1的HPLC分析

將收集的樣品冷凍干燥24 h，然后各加入200 μL正己烷和200μL三氟乙酸，立即旋緊蓋子，渦旋30 s。在40℃烘箱中衍生15 min，之后用氮氣吹干混合物，加入400μL水－乙腈（體積比85∶15）溶解殘余物并渦旋30 s，離心取上清，進行HPLC（安捷倫1100）分析［9］。

HPLC色譜柱：Benetnach ODS（4.6 mm×250 mm×12 nm，5μm）；流動相：乙腈－水［乙腈體積分?jǐn)?shù)15%～40%10 min，40%保持10 min］；體積流量：0.7 mL／min；進樣量：20μL；柱溫：25℃；檢測器：熒光檢測器；檢測波長：Ex 360 nm，Em 440 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母活細(xì)胞和死細(xì)胞對AFB1的清除能力

為了了解釀酒酵母對AFB1的清除性能是否受細(xì)胞存活狀態(tài)的影響，我們首先測定了酵母活細(xì)胞和死細(xì)胞在PBS緩沖液中對AFB1的結(jié)合能力。

4種釀酒酵母活細(xì)胞對AFB1的清除率為74%～76%（圖1（a））；經(jīng)高壓滅菌后，4種酵母細(xì)胞對AFB1的清除率維持在71%～73%之間（圖1（b）），略低于活細(xì)胞對AFB1的清除率；且在12 h和24 h時，各菌株對AFB1的清除率也基本保持不變。說明釀酒酵母對AFB1的清除以吸附作用為主，而生物轉(zhuǎn)化作用很弱，這與文獻報道的酵母細(xì)胞壁就具有真菌毒素脫毒功能相一致［10］。

圖1 釀酒酵母對PBS緩沖液中AFB1的結(jié)合能力Fig.1 Binding of AFB1 in PBS buffer by Sacchromyces cerevisiae

2.2 釀酒酵母活細(xì)胞在培養(yǎng)基中對AFB1的清除能力

考慮到在緩沖液中處于靜息狀態(tài)的活細(xì)胞和在培養(yǎng)基中處于生長狀態(tài)的活細(xì)胞可能會具有不同的AFB1清除能力，于是我們又測定了在YPD培養(yǎng)基中，野生菌BY4742和3種與抗氧化有關(guān)的基因缺失菌zwf1Δ、sod2Δ、glr1Δ對溶液內(nèi) AFB1的結(jié)合能力，結(jié)果見圖2。

圖2 釀酒酵母活細(xì)胞對溶液中AFB1的結(jié)合能力Fig.2 Binding of AFB1 in different solution by viable cells of Sacchromyces cerevisiae

在PBS緩沖液中，各釀酒酵母活細(xì)胞對AFB1的結(jié)合率都在12 h達到最大，12～48 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定，維持在74%～76%之間（圖2（a））。而在YPD培養(yǎng)基中，BY4742、zwf1Δ、sod2Δ3種菌株對AFB1的結(jié)合率也在12 h達到最大，但glr1Δ對AFB1的結(jié)合較慢，24 h才達到最高；這四種菌株在24 h之后，對AFB1的結(jié)合率都有所下降，從82%～48%降低至75%～31%（圖2（b））。在YPD培養(yǎng)基中，3種突變菌對AFB1的結(jié)合率明顯低于在PBS緩沖液中，說明突變菌在YPD培養(yǎng)基中生長時，細(xì)胞所面臨的氧化壓力影響了它們對AFB1的吸附和清除；或是培養(yǎng)基中的某些成分干擾了突變細(xì)胞對AFB1的吸附作用，降低了對AFB1的清除效果。但野生菌BY4742在YPD培養(yǎng)基中依然保持著較高甚至更高的AFB1清除能力，說明培養(yǎng)基中的成分并沒有影響到野生菌對AFB1的吸附和清除作用。

2.3 釀酒酵母抗氧化相關(guān)基因缺失后對AFB1清除能力的變化

對于釀酒酵母野生菌BY4742和3個關(guān)鍵的抗氧化相關(guān)基因突變菌zwf1Δ、sod2Δ、glr1Δ，不管是存活細(xì)胞還是死亡細(xì)胞，在與PBS緩沖液中的AFB1作用12 h后，它們對AFB1的清除率都幾乎相同，野生菌僅略高于突變菌0.9%～2.5%（圖3）。說明在PBS緩沖液中，這幾種關(guān)鍵的抗氧化相關(guān)基因缺失后，并不會顯著影響酵母細(xì)胞對AFB1的結(jié)合和清除能力。

圖3 釀酒酵母野生菌和基因缺失菌對AFB1的結(jié)合能力Fig.3 Binding of AFB1 by the wild－type and mutant cells of Sacchromyces cerevisiae

但是，當(dāng)酵母活細(xì)胞在YPD培養(yǎng)基中與AFB1作用12 h后，BY4742對AFB1的清除率（82.4%）明顯高于zwf1Δ、glr1Δ和sod2Δ，其中g(shù)lr1Δ對AFB1的清除率大幅下降，為44.8%，其次是sod2Δ（52.7%），而zwf1Δ下降較少，為65.6%（圖3）。

釀酒酵母的氧化壓力主要來自于有氧代謝中所產(chǎn)生的活性氧。為了抵抗這些活性氧的攻擊，細(xì)胞建立了一套完善的酶促抗氧化防御體系和非酶抗氧化防御體系。前者主要包括：清除超氧陰離子的超氧化物歧化酶（SOD），以及清除過氧化物或過氧化氫的過氧化物酶、過氧化氫酶等，而過氧化物酶需要還原型谷胱甘肽（GSH）或硫氧還蛋白作為其輔因子［11］。后者主要包括還原態(tài)GSH、硫氧還蛋白等分子［12］。而GSH還原態(tài)的維持由GSH還原酶催化完成，并需要由NADPH提供還原力。本研究中所涉及的ZWF1基因編碼HMP途徑的6－磷酸葡萄糖脫氫酶，是細(xì)胞內(nèi)NADPH的主要來源之一［13］；GLR1基因編碼 GSH 還原酶，負(fù)責(zé) GSH還原態(tài)的維持；SOD2基因編碼線粒體超氧化物歧化酶，負(fù)責(zé)清除超氧陰離子。當(dāng)這3個與抗氧化有關(guān)的關(guān)鍵基因缺失后，酵母細(xì)胞在生長狀態(tài)下對AFB1的吸附和清除能力顯著下降，尤以GSH還原酶基因GLR1的缺失影響最為嚴(yán)重，其次是線粒體超越化物歧化酶基因SOD2及6－磷酸葡萄糖脫氫酶基因ZWF1。GLR1基因的缺失導(dǎo)致非酶防御體系中還原型GSH的不足，并會減弱酶促防御體系中負(fù)責(zé)清除過氧化物的GSH過氧化物酶的活性，而SOD2基因的缺失會導(dǎo)致超氧陰離子的過度累積，ZWF1基因的缺失會降低NADPH的供應(yīng)水平，說明雖然這些基因的缺失與涉及毒素吸附的酵母細(xì)胞壁的合成無關(guān)，但細(xì)胞抗氧化功能出現(xiàn)不同程度的缺陷，影響到對AFB1的清除作用。

3 結(jié)語

所測試的幾株釀酒酵母不管是在存活狀態(tài)還是在死亡狀態(tài)下，都表現(xiàn)出對緩沖液中AFB1的優(yōu)良的清除能力，清除率達70%以上。但是在培養(yǎng)基中，幾種抗氧化相關(guān)基因缺失菌對AFB1的清除率表現(xiàn)出不同程度的下降，說明細(xì)胞抗氧化功能的缺陷會影響細(xì)胞在生長狀態(tài)下對毒素的吸附和清除作用。野生菌對AFB1的最高清除率可以達到82.4%，提示其在毒素清除方面的應(yīng)用潛力。

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Detoxification of Aflatoxin B1bySaccharomyces cerevisiaeMutants of Anti－Oxidative Relating Genes

SHI Feng1，HUANG Yu－xiao1，LI Yong－fu＊2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Aflatoxins are a group of mycotoxins with strong mutagenic and carcinogenic properties.Various commodities including crop and feed materials are easy to be contaminated with aflatoxin.Saccharomyces cerevisiae have been reported to bind or degrade aflatoxin.Here，detoxification of aflatoxin B1（AFB1）by wild－type strain ofS.cerevisiae（BY4742）and three mutants of anti－oxidative relating genes（zwf1Δ，sod2Δandglr1Δ）were determined by HPLC.In PBS buffer，AFB1binding abilities of viable and dead cells were 74%－76%and 71%－73%，respectively，indicating AFB1was removed by yeast cells mainly through cell adsorption.In YPD medium，clearance of AFB1by three mutant viable cells reduced，while that by wildtype BY4742 remaining high.AFB1binding ability ofglr1Δdecreased most seriously，then was that ofsod2Δandzwf1Δ.Thus，the deletion of critical anti－oxidative relating genes would decrease the AFB1binding ability ofS.cerevisiaegrowing cells.

aflatoxin，Saccharomyces cerevisiae，anti－oxidative gene，detoxification

＊通信作者：李永富（1969－），男，江蘇盱眙人，工學(xué)碩士，副教授，主要從事糧食資源的綜合利用研究。E－mail：liyf＠jiangnan.edu.cn

TS 26

A

1673－1689（2012）05－0468－05

2011－06－17

國家自然科學(xué)基金項目（No.30870056）。

史鋒（1970－），女，江蘇丹陽人，工學(xué)博士，副教授，主要從事微生物化與分子生物學(xué)研究。E－mail：shifeng＠jiangnan.edu.cn