DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-雜氮-2′-脫氧胞苷對人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的影響

莫正英 王鳳琴 梁清樂

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國南方地區(qū)常見的1種惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均居世界首位，嚴(yán)重威脅我國人民的身體健康和生命。盡管人們一直在探索鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制，但鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制還不清楚。大量的研究表明[1～3]，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多階段的病理過程，其中癌基因的激活和抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生與發(fā)展的重要原因，而啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化又是抑癌基因失活的重要機(jī)制之一。抑癌基因失活的主要方式有基因的缺失、突變和啟動(dòng)子區(qū)域的過甲基化等[4]，尤其是抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島過甲基化是腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)之一。DNA甲基化(DNA methylation)修飾是基因表達(dá)調(diào)控的重要表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一，它通過延遲DNA復(fù)制、抑制轉(zhuǎn)錄起始、改變?nèi)旧|(zhì)的物理或化學(xué)結(jié)構(gòu)使基因轉(zhuǎn)錄沉默(silencing)，導(dǎo)致基因功能失活[5]。5-雜氮-2′-脫氧胞苷(5-aza-2dC)是1種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT 1)的抑制劑，很多體外研究證實(shí)，5-aza-2dC通過去甲基化作用使多種CpG島過甲基化的抑癌基因重新表達(dá)，而恢復(fù)抑癌功能[6，7]。但5-aza-2dC對人低分化鼻咽鱗癌細(xì)胞株CNE2的作用少見報(bào)道。為探討DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-2dC對人低分化鼻咽鱗癌細(xì)胞株CNE2的影響，本研究以CNE2細(xì)胞株為樣本，用不同濃度5-aza-2dC處理CNE2細(xì)胞，使它的甲基化沉默基因重新表達(dá)，檢測其對CNE2的影響，為臨床治療提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE2購于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。奈達(dá)鉑(nedaplatin,NDP)(江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司產(chǎn)品)；5-aza-2dC(美國Sigma公司)，RPMI 1640培養(yǎng)液(美國GIBCO公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，MTT(Amresco公司)，二甲亞砜(DMSO,SIGMA公 司)，酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-RAD550，美國伯樂公司)，流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制 5-aza-2dC用含10% 小牛血清的RPMI 培養(yǎng)液溶解，配成濃度為10-3mol/L的儲存液，-20℃保存，使用時(shí)用RPMI 培養(yǎng)液稀釋為工作液。MTT溶于PBS中，過濾除菌，濃度為5 mg/ml，避光冷藏。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) CNE2細(xì)胞在RPMI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)(10%小牛血清)，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用4 g/L苔盼藍(lán)染色后計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率達(dá)99%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×105/ml備用。

1.2.3 5-aza-2dC處理鼻咽癌細(xì)胞 CNE2細(xì)胞以104/ml密度接種到96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后換含5-aza-2dC新鮮培養(yǎng)液，每24 h更換含有5-aza-2dC的培養(yǎng)液，對照組CNE2細(xì)胞用不含5-aza-2dC的培養(yǎng)液同時(shí)培養(yǎng)。

1.3 MTT比色法檢測5-aza-2dC對鼻咽癌細(xì)胞生長的影響

96孔板接種細(xì)胞，每孔104個(gè)，每孔均加入200 μl含10% 小牛血清RPMI 1640完全培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h細(xì)胞完全貼壁后吸出每個(gè)孔的培養(yǎng)液，分別加入10-7、10-6、10-5、10-4mol/L濃度的5-aza-2dC處理，以不加藥物為陰性對照組，以奈達(dá)鉑(1 μg/ml)處理為陽性對照組，每孔中體積為200 μl。每組3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)0、12、24、36、48、72 h，按照培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)終止前4 h加入MTT液20 μl/孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后吸取培養(yǎng)液，每空加入150 μl DMSO,平板震蕩10 min，應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測儀，于490 nm波長處測定各孔吸光度OD值，然后繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測5-aza-2dC對鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響

CNE2細(xì)胞處理同1.2.3，5-aza-2dC處理 72 h后，收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，2 000 r/min離心5 min，棄去上清，PBS洗3次；70%預(yù)冷的乙醇、4℃固定2 h，調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/ml，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5 甲基化特異性PCR檢測DAPK 啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)

DARK基因甲基化引物。甲基化引物，上游 5′-GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC-3′；下游 5′-CCCT-CCCAAACGCCGA-3'； 片段長度98 bp。非甲基化引物，上游 5′-GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT-3′；下游 5′-CAAATCCCTCCCAAACACCAA-3′；片段長度108 bp。 以β-actin為內(nèi)參，逆轉(zhuǎn)錄后行目的基因和β-actin cDNA擴(kuò)增。分別取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 μl用于PCR檢測。 50 μl 體系包括：10×PCR buffer 5 μl ，2.5 mmol/L dNTP mix 4 μl ，上、下游引物各20 pmol，Taq DNA polymerase 0.4 μl ，模板cDNA 2.5 μl,滅菌水36.1 μl。VEGF PCR 條件：94℃預(yù)變性3 min,94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 1 min,30次循環(huán)，72℃延伸10 min。取PCR 產(chǎn)物置于2%瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色，電泳條帶經(jīng)電泳圖像分析儀照相。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有資料均應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測細(xì)胞增殖

不同濃度5-aza-2dC處理CNE2細(xì)胞0、6、12、24、48、72 h后，MTT比色法檢測細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示隨著抑制劑濃度的增加和處理時(shí)間的延長，其抑制CNE2細(xì)胞增殖作用增強(qiáng)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示同一作用時(shí)間下不同藥物濃度組間，細(xì)胞生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),10-4mol/L 5-aza-2dC處理CNE2細(xì)胞72 h，對細(xì)胞增殖抑制作用最明顯(P<0.05)，見圖1。

圖1 不同濃度5-aza-2dC處理CNE2細(xì)胞的增殖曲線

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測5-aza-2dC對鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度5-aza-2dC處理CNE2細(xì)胞72 h后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)10-4mol/L 5-aza-2dC誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡最明顯(P<0.01)(表1)。結(jié)合MTT結(jié)果，發(fā)現(xiàn)10-4mol/L 5-aza-2dC處理CNE2細(xì)胞72 h細(xì)胞凋亡最明顯。

表1 不同濃度5-aza-2dC對鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響

注 *為與對照組比較,P<0.01

2.3 5-aza-2dC對CNE2細(xì)胞DAPK啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的影響

MSP法檢測CNE2細(xì)胞DAPK啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的結(jié)果顯示：甲基化引物的擴(kuò)增條帶為陽性，非甲基化引物擴(kuò)增條帶為陰性。5-aza-2dC作用后，CNE2細(xì)胞甲基化引物擴(kuò)增條帶為陰性，非甲基化引物擴(kuò)增條帶為陽性，見圖2。

圖2 5-aza-2dC處理前后CNE2細(xì)胞DAPK啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

3 討論

鼻咽癌是1種極具特色的腫瘤，有著奇特的分布和復(fù)雜的病因?qū)W。在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中，癌基因激活或過度表達(dá)并不是一個(gè)主要因素。在鼻咽癌中，經(jīng)典的癌基因如ras基因及mdm2基因的突變在鼻咽癌中并不多見，相反，在鼻咽癌的演進(jìn)過程中，腫瘤抑制基因的失活卻更為普遍，且發(fā)揮更重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌中存在多個(gè)腫瘤抑制基因的失活。而近年來研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤抑制基因在鼻咽癌中因甲基化而失活，相對于突變及基因缺失，鼻咽癌中腫瘤抑制基因的表觀遺傳學(xué)改變?yōu)楦毡閇8]。啟動(dòng)子區(qū)CpG 島高甲基化是腫瘤抑制基因失活的基本機(jī)制[9]。在鼻咽癌中腫瘤相關(guān)基因的甲基化改變參與了包括細(xì)胞周期調(diào)控、DNA 修復(fù)、細(xì)胞凋亡及腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的全過程。DNA過甲基化是引起抑癌基因失活的重要方式，DNA過甲基化并不是基因序列發(fā)生改變，而只是部分堿基對發(fā)生甲基化修飾，這種異常的甲基化模式是可以逆轉(zhuǎn)的[10]。5-aza-2dC是DNMT1的抑制劑，在DNA復(fù)制過程中與DNA分子相結(jié)合，并與DNMT1形成一共價(jià)復(fù)合物，抑制該酶的甲基轉(zhuǎn)移活性，生成低甲基化子鏈，從而實(shí)現(xiàn)去甲基化功能，恢復(fù)多個(gè)抑癌基因的表達(dá)。5-aza-2dC可使多種因甲基化而失活的抑癌基因重新表達(dá)，并且可以誘導(dǎo)凋亡，體外實(shí)驗(yàn)證明其可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長[11，12]。 本研究顯示人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE2經(jīng)過5-aza-2dC處理后，細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生明顯改變，經(jīng)MTT法檢測的細(xì)胞生長曲線可以看出細(xì)胞增殖受到不同程度的抑制。說明5-aza-2dC可以抑制人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，并且抑制作用呈濃度依賴性，隨著濃度增大其抑制作用也越強(qiáng)。在48～72 h內(nèi)，同一濃度5-aza-2dC隨著作用時(shí)間的延長，其抑制作用也增強(qiáng)，在10-4mol/L作用72 h時(shí)抑制作用最強(qiáng)。流式細(xì)胞儀檢測也顯示出細(xì)胞凋亡與5-aza-2dC的作用濃度呈依賴性，在10-4mol/L濃度下作用72 h后，細(xì)胞凋亡數(shù)最多，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果和MTT檢測結(jié)果都說明5-aza-2dC在10-4mol/L濃度下，處理人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE2能產(chǎn)生明顯的生物學(xué)效應(yīng)，能抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

MSP技術(shù)分別檢測5-aza-2dC處理前后DAPK啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)處理前CNE2細(xì)胞中DAPK啟動(dòng)子區(qū)為高甲基化狀態(tài)，而處理后的CNE2細(xì)胞中DAPK啟動(dòng)子區(qū)恢復(fù)非甲基化狀態(tài)，其機(jī)制可能是使因甲基化而失活的抑癌基因重新激活而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。本結(jié)果說明，5-aza-2dC在體外可能是通過將人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE2中因甲基化而失活的某些抑癌基因去甲基化而重新表達(dá)，從而恢復(fù)其抑制腫瘤生長的功能，并且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制了人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的生長。

綜上，5-aza-2dC在體外可以抑制人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE2增殖，其作為1種甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可以激活人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE2中因甲基化而失活的某些抑癌基因，從而恢復(fù)抑制腫瘤生長的功能，引起細(xì)胞凋亡，為臨床治療用藥提供了一個(gè)新的思路，為以后5-aza-2dC在鼻咽癌中的研究提供科學(xué)依據(jù)。

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