急性心肌梗死后快速延遲整流K+通道基因表達的變化

李秀娟，黃從新，丁家望，楊 俊，吳 輝，李 莉，李 松，李穩(wěn)慧，姜玉蓉

(1.三峽大學第一臨床學院/宜昌市中心人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北宜昌 443003；2.武漢大學人民醫(yī)院心內(nèi)科，武漢 430000)

K+通道對心肌細胞的電生理穩(wěn)定性調(diào)控起著非常重要的作用[1-2]。人類ether--go-go相關基因HERG基因編碼心臟快速延遲整流K+電流Ikr，Ikr是心肌細胞動作電位3期快速復極的主要電流，在心臟動作電位復極化過程中發(fā)揮重要作用。HERG/KCNH2及其調(diào)節(jié)亞基KCNE2基因突變可引起LQTs 綜合征[3-4]，心肌梗死(MI)并發(fā)的心律失常是導致病情惡化和死亡的主要原因之一。MI后心室肌膜多種K+通道基因表達的變化已成為近年研究熱點，但是關于MI后HERGK+通道基因表達變化的研究有限，尤其是對大型動物如豬的研究尚屬少見。本研究以開胸冠狀動脈(冠脈)結扎法制備豬急性心肌缺血模型,用RT-PCR 方法觀察MI后左心室梗死邊緣區(qū)3層心肌快速延遲整流K+通道基因HERG/KCNH2及其調(diào)節(jié)亞基KCNE2基因的mRNA表達改變及其意義，旨在探討急性心肌梗死(AMI)后早期室性心律失常發(fā)生的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 普通級小型豬，3～5 月齡，體質(zhì)量10～15 kg(華中農(nóng)業(yè)大學動物中心提供)，雌雄不限。術前常規(guī)檢查心電圖,心電圖異常者剔除，隨機分為假手術組(SH組)和模型組(MI組)，共16只動物。

1.2MI動物模型的建立 所有的實驗動物均術前禁食、禁飲12 h。術前稱質(zhì)量,予以3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，在口腔明視下行氣管插管,以呼吸機機械通氣,潮氣量10～15 mL/kg，給氧3～5 L/min，頻率20～25次/分鐘。常規(guī)消毒鋪巾，于胸骨正中打開胸腔,縱行切開心包膜,充分暴露心臟,并將心包膜縫合于胸壁呈吊籃狀。仔細分離冠狀動脈,于冠狀動脈左前降支(LAD)遠端1/3～1/2處穿入4號縫合線,AMI組結扎2 h,再松解恢復前降支血流,建立AMI模型,其成功標志為:心電圖ST段弓背向上抬高,直視下可見被結扎血管供血區(qū)心肌變?yōu)樯n白色。SH組也重復上述步驟,但冠狀動脈下只穿線,不結扎。逐層縫合心包、胸壁，并放置引流管.術后精心喂養(yǎng)動物至實驗終點。取結扎后存活的豬,分入MI組,建立SH組,所有豬均接受相同的飼養(yǎng)條件。

1.3標本的采集與保存 MI組和SH組的每只豬于術后24 h,用3%的戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，迅速取出心臟置于4 ℃生理鹽水漂洗除去血液，依照Gao等[5]的方法留取左心室梗死邊緣區(qū)3層心肌(SH組取對應位置心肌),迅速置-70 ℃低溫冰箱保存待測。

1.4心肌總RNA的提取和KCNH2及KCNE2 mRNA檢測 取50～100 mg豬心肌,按照Trizol(Invitrogen公司)RNA 抽提試劑盒說明書的步驟進行，提取組織總RNA，紫外光檢測樣品吸光度，A260/A280為1.95～2.10。應用RT-PCR法(試劑盒購于大連寶生物工程有限公司)檢測mRNA的表達,50 ℃ 30 min,94 ℃預變性2 min,PCR擴增29個循環(huán)(94 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸4 min)。KCNH2引物(257 bp):上游5′-TGA AGG AGA CGG AGG AG-3′，下游5′-CAG AGC CGA AGA TGA GC-3′，(退火溫度57.2 ℃)；KCNE2引物(157 bp)：上游5′-TAC TAC GTC ATC CTG TAC C-3′，下游5′-TGA CTC TTG TAT TTC CCT TGC -3′，(退火溫度56.0 ℃)；β-actin引物(498 bp)：上游5′-GGC TAC AGC TTC ACC ACC AC-3′；下游5′-TACT CCT GCT TGC TGA TCC AC-3′(退火溫度60 ℃)；1.5%瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物,應用凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄結果,用光密度掃描計算KCNH2電泳條帶灰度積分/B-actin電泳條帶灰度積分和KCNE2電泳條帶灰度積分/B-actin電泳條帶灰度積分，進行半定量分析。

2 結 果

2.1動物存活情況 AMI組中9只存活6只,另外3只于術中發(fā)生室顫，經(jīng)心內(nèi)除顫無效死亡;SH組中7只，1只因麻醉意外死亡,其余6只存活。

表1 兩組不同部位KCNH2及KCNE2

#：P<0.05，與SH組比較；△：P<0.05，與MI組Endo比較；□：P<0.05，與MI組Mid比較；▽：P<0.05，與MI組Epi比較。

圖1 MI組和SH組梗死邊緣區(qū)3層心肌的KCNH2 mRNA(257 bp)與β-actin(498 bp)RT-PCR電泳圖

2.2兩組豬心肌KCNH2和KCNE2基因mRNA表達的變化 KCNH2和KCNE2基因表達在SH組左心室內(nèi)層(Endo)、中層(Mid)和外層(Epi)心肌間沒有差異，與SH組比較,AMI后梗死邊緣區(qū)3層心肌KCNH2 mRNA表達均明顯下降(P<0.05),而且3層心肌間的基因表達呈不均一性(P<0.05)，KCNE2 mRNA表達量無顯著性差異，結果見表1，圖1、2。

MI組，A1：Endo；B1：Mid；C1：Epi。SH組，A2：Endo；B2：Mid；C2：Epi。

圖2 MI組和SH組梗死邊緣區(qū)3層心肌的KCNE2 mRNA(157 bp)與β-actin (498 bp)RT-PCR電泳圖

3 討 論

IKr是HERG/KCNH2和KCNE2表達的兩種蛋白質(zhì)共同形成功能性K+通道,KCNH2本身單獨可產(chǎn)生一種小的快速激活外向K+電流，KCNE2本身并不能產(chǎn)生任何離子電流，但它的存在主要影響通道的門控性和藥理學性質(zhì)。目前，關于HERG及其調(diào)節(jié)亞基KCNE2基因突變可引起LQTs綜合征的研究較多，但在MI后HERG及其調(diào)節(jié)亞基KCNE2基因的表達有何改變，這些改變在心律失常中所起的確切作用尚不是很清楚。

有研究表明，在心肌缺血初始的短時間內(nèi)，先出現(xiàn)IK的抑制，此為細胞的代償性保護性反應被激發(fā)的表現(xiàn)，隨缺血持續(xù)出現(xiàn)IK增大(主要是IKr)則為損傷性反應的表現(xiàn)。心肌缺血時時間依賴性K+流(包括IK)和KATP的開放又是造成細胞內(nèi)K+丟失外流的主要途徑[6]，由此形成惡性循環(huán)，持續(xù)缺血最終使細胞內(nèi)外K+平衡完全失調(diào)。同時由于IK的增大，可加快心肌細胞復極，使動作電位時程及ERP縮短，心肌細胞電生理特性發(fā)生改變。由此可見，MI后IKr電流的電生理特性發(fā)生了改變，這可能是心肌梗死后易發(fā)心律失常的機制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，KCNH2和KCNE2基因表達在SH組左心室Endo、Mid和Epi心肌間沒有差異，這與Arun等[7]及Kaori等[8]對快速延遲整流K+通道在左室心肌3層間表達的研究結果相一致。而MI 24 h后KCNH2 mRNA的表達量在邊緣區(qū)降低,KCNH2 mRNA表達水平的下調(diào)，可以造成有功能的快速延遲整流K+通道的數(shù)目減少，有助于IKr電流的減小，可能是心肌細胞在恢復期的一種代償性保護性反應，使膜K+電流變小，K+外流減少，促進急性缺血所造成的細胞內(nèi)外K+平衡失調(diào)的恢復。但是IKr電流的減小，可使心室肌細胞APD延長，心肌細胞電生理特性改變，易于形成觸發(fā)活動，產(chǎn)生心律失常。同時KCNH2 mRNA的表達在左心室梗死邊緣區(qū)Endo、Mid 和Epi心肌之間產(chǎn)生了明顯的差異，使空間異質(zhì)性增大，可導致復極不均一，復極離散度增大，易于形成折返發(fā)生心律失常。

雖然本研究顯示KCNE2 mRNA表達水平在兩組間沒有變化，而且KCNE2本身并不能產(chǎn)生任何離子電流，但它的存在影響通道的門控性和藥理學性質(zhì)，當KCNH2 mRNA的表達在左心室梗死邊緣區(qū)Endo、Mid和Epi心肌之間產(chǎn)生了明顯差異時，KCNE2 mRNA表達水平?jīng)]有產(chǎn)生相應的變化，使IKr在整體行為，對細胞外K+及抗心律失常藥物的敏感性和通道的失活速率等方面發(fā)生改變，也可使空間異質(zhì)性增大，導致復極不均一，復極離散度增大，易于形成折返發(fā)生心律失常；同時也可增加了電流的不穩(wěn)定性和發(fā)生心律失常的易感性。

因此，K+通道KCNH2 mRNA表達的下調(diào)和在不同部位改變的不均一可能在電生理不穩(wěn)定的維持和(或)惡化方面起一定的作用，但這種變化確切意義和KCNH2和KCNE2基因兩者之間的相互作用還有待進一步深入研究。

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