糖尿病大鼠胰島B細(xì)胞損傷的形態(tài)定量研究*

文曉紅，郭 洋，向 宇，代小思，鄧世山

(川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川南充 637007)

在糖尿病的防治中,選擇適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施保護(hù)殘存的胰島B細(xì)胞至關(guān)重要。目前，在運(yùn)用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)糖尿病動(dòng)物模型進(jìn)行胰島B細(xì)胞損傷的保護(hù)性藥物篩選方面的研究中，有關(guān)藥物治療后胰島B細(xì)胞數(shù)量能否恢復(fù)的研究報(bào)道較多[1-2]，但對(duì)胰島B細(xì)胞損傷后如果不采取任何干預(yù)措施，其數(shù)量隨著病程的延長(zhǎng)能否自行恢復(fù)卻很少有研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用體視學(xué)形態(tài)定量研究方法，結(jié)合血清胰島素、空腹血糖測(cè)量等方法，探討胰島B細(xì)胞損傷后能否自行恢復(fù)，為胰島B細(xì)胞損傷的保護(hù)作用方面的研究提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 雄性SD大鼠，10～12周齡，體質(zhì)量280～320 g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。STZ(瑞士ALEXIS公司)；ONETOUCH SureStep微血糖測(cè)量?jī)x(中國(guó)強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司)；穩(wěn)步醫(yī)院用血糖試紙(美國(guó)LifeScan Inc)；RAT/MOUSE INSULIN ELISA KIT(美國(guó)LINCO Research)；抗胰島素抗體(一抗)及SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；Olympus BX50型生物顯微鏡(日本Olympus公司)；體視學(xué)圖像系統(tǒng)(川北醫(yī)學(xué)院與北京馳馬特圖像技術(shù)有限公司及四川大學(xué)聯(lián)合研制)。

1.2動(dòng)物分組及藥物注射 動(dòng)物分2批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。第1批大鼠38只，隨機(jī)分為對(duì)照組9只，實(shí)驗(yàn)組29只；第2批大鼠46只，隨機(jī)分為對(duì)照組10只，實(shí)驗(yàn)組36只。自由攝取水和大鼠標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。將STZ臨用前以0.1 mol/L(pH 4.2)的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液溶解。在不禁食的條件下，實(shí)驗(yàn)組按60 mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射STZ；對(duì)照組一次性腹腔內(nèi)注射等量的緩沖液。

表1 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的血糖、血清胰島素和形態(tài)定量結(jié)果±s)

1.3檢測(cè)指標(biāo) 在注射藥物前和注射后的第7天(第1批和第2批)和第84天(第2批)，給動(dòng)物禁食、禁水7 h后測(cè)空腹血糖(剪尾取血，用微血糖測(cè)量?jī)x及配套的血糖試紙，最大血糖值為27.8 mmol/L，更高的血糖值儀器顯示為H，這種情況血糖值被當(dāng)作為27.8 mmol/L)。在注射藥物后第7天(第1批)和第84天(第2批)，取血并分離血清，檢測(cè)血清胰島素(ELISA法，操作嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書進(jìn)行，用Anthos2010酶標(biāo)儀采用雙波長(zhǎng)測(cè)OD值，根據(jù)試劑說(shuō)明給定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相對(duì)應(yīng)的濃度值)。

1.4取材及標(biāo)本處理 在注射藥物后第7天(第1批)和第84天(第2批)，處死大鼠，取出胰腺置Bouin液內(nèi)浸潤(rùn)固定，70%乙醇脫水，分離胰腺并稱質(zhì)量后，行組織塊等距隨機(jī)抽樣，每個(gè)胰腺共抽選4個(gè)組織塊；將4個(gè)組織塊放入一個(gè)包埋盒中用石蠟包埋；每個(gè)石蠟包埋塊切取5 μm厚的切片1張；進(jìn)行胰島素免疫組織化學(xué)SABC法染色，操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5形態(tài)學(xué)觀察與形態(tài)定量 使用Olympus BX50型生物顯微鏡和體視學(xué)圖像系統(tǒng)觀察切片，記錄胰島內(nèi)胰島素免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞(胰島B細(xì)胞)核的多少、大小和染色的深淺情況。用體視學(xué)方法測(cè)量以下指標(biāo)：(1)胰腺體積：胰腺的質(zhì)量除以胰腺密度1.021(胰腺的密度用已知濃度、比重的乙醇溶液測(cè)得)；(2)胰島總體積：胰腺體積乘以胰島的體積分?jǐn)?shù)即胰島的總體積[3]；(3)胰島總面積：每張切片隨機(jī)抽選胰島(不超過(guò)20個(gè))，并利用測(cè)試系統(tǒng)軟件在圖像上隨機(jī)疊加12×13規(guī)則排列的156個(gè)測(cè)點(diǎn)(點(diǎn)間距25 μm×30 μm)，計(jì)數(shù)位于胰島內(nèi)的總測(cè)點(diǎn)數(shù)，胰島內(nèi)的總測(cè)點(diǎn)數(shù)乘以每一測(cè)點(diǎn)所關(guān)聯(lián)的測(cè)面面積(25 μm×30 μm)，就是胰島總面積；(4)單位面積胰島內(nèi)B細(xì)胞核數(shù)量(NA)：計(jì)數(shù)隨機(jī)抽選的胰島內(nèi)B細(xì)胞核的總個(gè)數(shù)，B細(xì)胞核的總個(gè)數(shù)除以胰島總面積即得單位面積胰島內(nèi)B細(xì)胞核數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1空腹血糖、血清胰島素 第1批大鼠的實(shí)驗(yàn)組在注射STZ后第7天血糖達(dá)成模標(biāo)準(zhǔn)(血糖>11.1 mmol/L[4])的大鼠(成模7 d組)有7只；第2批大鼠的實(shí)驗(yàn)組在注射STZ后第7天血糖達(dá)成模標(biāo)準(zhǔn)且成活至第84天的大鼠(成模84 d組)有8只。成模7 d組、成模84 d組及其正常對(duì)照組在注射藥物前和取材前的血糖以及血清胰島素見(jiàn)表1。

2.2形態(tài)學(xué)觀察與形態(tài)定量 對(duì)照組所有胰島內(nèi)B細(xì)胞數(shù)量多，占據(jù)胰島的大部分；胰島素表達(dá)強(qiáng)，胞質(zhì)內(nèi)含大量棕黃色顆粒；核的大小、形態(tài)一致(封3圖1)。成模組所有胰島內(nèi)B細(xì)胞數(shù)量減少；胰島素表達(dá)明顯減弱，細(xì)胞內(nèi)胰島素顆粒染色深淺有較大差異；有的B細(xì)胞核直徑增大(封3圖2)。成模7 d組、成模84 d組及其正常對(duì)照組的胰腺體積、胰島總體積、胰島總面積、B細(xì)胞核的總數(shù)和單位面積胰島內(nèi)B細(xì)胞核數(shù)量(NA)見(jiàn)表1。

3 討 論

胰島B細(xì)胞的再生主要包括：(1)B細(xì)胞增生：主要來(lái)自成體干細(xì)胞或前體細(xì)胞，胚胎發(fā)育晚期及新生期是B細(xì)胞增生的高峰期，成年后只有當(dāng)胰島受到嚴(yán)重?fù)p傷或在大量GLP-1刺激下，干細(xì)胞才有可能分化為B細(xì)胞。(2)B細(xì)胞自我復(fù)制：出生以后B細(xì)胞數(shù)量的維持主要是已有B細(xì)胞的復(fù)制和凋亡之間的平衡[5]。目前，人們關(guān)心的是藥物治療后糖尿病動(dòng)物胰島B細(xì)胞數(shù)量能否恢復(fù)，但對(duì)胰島B細(xì)胞損傷后如果不采取任何干預(yù)措施，其數(shù)量隨著病程的延長(zhǎng)能否自行恢復(fù)的報(bào)道少。如有研究表明新生大鼠或胎鼠的胰島B細(xì)胞損傷后能夠部分恢復(fù)[6-7]，另有研究報(bào)道，成年大鼠注射STZ后，隨著糖尿病病程的推進(jìn),通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)胰島B細(xì)胞進(jìn)一步減少，到6個(gè)月時(shí)許多胰島內(nèi)只殘留2～3個(gè)B細(xì)胞,有的甚至缺如[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體視學(xué)形態(tài)定量研究表明，與對(duì)照組比較，糖尿病成模大鼠在注射STZ后第7天(成模7d組)的胰島總體積、胰島總面積、B細(xì)胞核的總數(shù)、單位面積胰島內(nèi)B細(xì)胞核數(shù)量和血清胰島素分別減少了75%、52%、90%、73%和67%(P<0.05)，空腹血糖升高了194%(P<0.05)；第84天(成模84d組)的胰腺體積、胰島總體積、胰島總面積、B細(xì)胞核的總數(shù)、單位面積胰島內(nèi)B細(xì)胞核數(shù)量和血清胰島素分別減少了13%、89%、76%、94%、79%和92%(P<0.05)，空腹血糖升高了350%(P<0.05)，說(shuō)明成模大鼠的胰島B細(xì)胞已受到嚴(yán)重的損傷，分泌胰島素的功能明顯降低，空腹血糖明顯升高。而成模大鼠的胰腺體積、胰島總體積、胰島總面積、B細(xì)胞核的總數(shù)和單位面積胰島內(nèi)B細(xì)胞核數(shù)量在第7天和第84天差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；形態(tài)學(xué)觀察在第7天和第84天也無(wú)明顯區(qū)別；血清胰島素在第84天比第7天減少了71%(P<0.05)；空腹血糖在第84天比第7天升高了30%(P<0.05)，說(shuō)明成模大鼠的胰島B細(xì)胞受到嚴(yán)重的損傷后，如果不

采取干預(yù)措施，隨著病程的延長(zhǎng)，雖然有新的B細(xì)胞形成，但B細(xì)胞的自我復(fù)制不足以補(bǔ)償其數(shù)量的減少，故B細(xì)胞數(shù)量不能自行恢復(fù)，空腹血糖也沒(méi)有出現(xiàn)自發(fā)性緩解的現(xiàn)象。

另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，正常成年雄性大鼠胰島總體積在11～13周齡時(shí)為(6.06±1.62)μL3，而到24～26周齡時(shí)增長(zhǎng)為(10.3±3.47)μL3，增長(zhǎng)了70%(P<0.05)，說(shuō)明胰島總體積隨著動(dòng)物的年齡增加而增長(zhǎng)；正常成年雄性大鼠B細(xì)胞核的總數(shù)在11～13周齡時(shí)為(229±74)個(gè)，而到24～26周齡時(shí)增加到(350±143)個(gè)，增加了53%(P<0.05)，但同時(shí)胰島總面積也增加了82%(P<0.05)，故單位面積胰島內(nèi)B細(xì)胞核數(shù)量在11～13周齡時(shí)和24～26周齡時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明單位面積胰島內(nèi)B細(xì)胞數(shù)量不隨動(dòng)物的年齡而增加，推測(cè)可能是在非糖尿病狀態(tài)下B細(xì)胞再生與凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡所致。

綜上所述，給大鼠一次性注射大劑量STZ(60 mg/kg)后，成模大鼠的胰島B細(xì)胞受到嚴(yán)重的損傷，如果不采取干預(yù)措施，隨著病程的延長(zhǎng)，B細(xì)胞數(shù)量不能自行恢復(fù)，空腹血糖也就一直處于高血糖水平。

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