高效液相色譜法快速測定乳粉中葉黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

王瑾，陳萬勤，陳小珍，張東雷

（浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測研究院，杭州 310013）

高效液相色譜法快速測定乳粉中葉黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

王瑾，陳萬勤，陳小珍，張東雷

（浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測研究院，杭州 310013）

建立一種測定配方奶粉中葉黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高效液相色譜方法。采用Diamonsil C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），流動相為甲醇-水（97∶3），流速1.0 mL/min,檢測波長445 nm，采用空白基質(zhì)加標(biāo)實驗繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法在0.5～100 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R=0.9987）,加標(biāo)水平為0.50，1.00，5.00 μg/g時，回收率分別介于96.8%～98.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差介于4.27%～6.73%之間，該方法檢測限低于0.10 μg/g。該方法操作簡便，靈敏度高、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，適合于配方奶粉中葉黃素的測定。

葉黃素；高效液相色譜；配方奶粉

0 引言

葉黃素是一種屬于胡蘿卜素的黃色物質(zhì)，具有增色和營養(yǎng)雙重功效。在自然界中主要存在于綠色、桔黃色蔬菜、獼猴桃和玉米等食品中。研究表明：葉黃素能夠預(yù)防眼睛光損傷，防止葉黃素缺失引起的視力退化和失明癥，以及因機體衰老引發(fā)的心血管硬化、冠心病和腫瘤等疾病[1]。葉黃素是母乳中的重要成分，可以保護(hù)嬰幼兒的視網(wǎng)膜，免受藍(lán)光傷害，有益于嬰幼兒的眼睛發(fā)育，因此許多乳粉生產(chǎn)企業(yè)在配方乳粉中添加了葉黃素，標(biāo)簽也明確標(biāo)注出其含量。

目前已有文獻(xiàn)報道大都采用HPLC法測定甘薯葉片、萬壽菊莖、萬壽菊花、胡蘿卜汁、血清等樣品中的葉黃素含量[2-7]，針對于乳粉中葉黃素含量的測定未見報道。因此，本文應(yīng)用HPLC技術(shù)建立了適用于配方乳分中葉黃素的測定方法，該方法線性相關(guān)性好、方法簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確、精密度好。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

美國Waters 2695型高效液相色譜儀（配自動進(jìn)樣器），電子天平，恒溫水浴鍋，旋發(fā)儀，氮吹儀，渦旋儀，250 mL具塞三角瓶、500mL分液漏斗等。

葉黃素(標(biāo)準(zhǔn)品，F(xiàn)LUKA)，抗壞血酸，無水乙醇（分析純），甲醇（色譜純），石油醚（30-60℃沸程），氫氧化鉀（分析純），無水硫酸鈉（分析純），蒸餾水。

1.2 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容配成質(zhì)量濃度為0.5 g/L儲備液（-20℃保存）；吸取該標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL于10 mL容量瓶中用甲醇稀釋定容，配成質(zhì)量濃度為50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液備用（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.3 高效液相色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（5 m，250 mm×4.6 mm）或相當(dāng)者；流動相為甲醇、水（甲醇/水=97/3，體積比）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為445 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

1.4 前處理過程

稱取乳粉試樣10.0 g試樣于250 mL具塞三角瓶中，加入1.5 g抗壞血酸（維生素C），加入30 mL溫度為50～60℃熱水，試樣溶解混勻后，加入100 mL無水乙醇，充分混勻后緩慢加入50 g氫氧化鉀（邊加邊搖），充氮氣排出空氣后蓋上瓶塞，置于75℃恒溫水浴鍋中避光皂化1 h（皂化過程中，每隔15 min混勻一次），取出冷卻至室溫，將皂化液全部轉(zhuǎn)入500 mL分液漏斗中，并用蒸餾水洗三角瓶并入分液漏斗中，用200 mL石油醚分兩次萃取皂化液，合并兩次萃取液用蒸餾水洗滌至中性，用無水硫酸鈉脫水后，35℃負(fù)壓選裝蒸發(fā)至近干，N2吹干。殘留物用2.0 mL甲醇溶解，過膜后上機測定。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)系列處理

由于葉黃素性見光易分解，故整個實驗過程盡量在避光條件下操作。按照樣品的前處理過程做系列空白加標(biāo)實驗，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離條件的選擇

本研究比較了甲醇、甲醇-水作為流動相，并比較了不同梯度對分離結(jié)果的影響。較合理的梯度條件為甲醇-水（97+3），樣品中能達(dá)到基線分離、峰形好，沒有拖尾，且分析時間較短，試劑成本較低。

2.2 檢測波長的選擇

取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用紫外分光光度計，在400～500 nm波長范圍內(nèi)掃描，檢測到葉黃素在445 nm處有最大吸收，故選擇445 nm為葉黃素的檢測波長。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確移取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，添加到10.0 g空白試樣中，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10，0.20，0.50，1.00，5.00，10.00，20.00 μg/g的各系列空白添加試樣，按1.4進(jìn)行前處理，得到測試用系列標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5，1，2.5，5，25，50，100 mg/L（質(zhì)量濃度），按1.3條件進(jìn)行測定，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，實驗結(jié)果為葉黃素在0.5～100 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性，其回歸方程y=44330x–17568，r= 0.9987，檢出限為0.10 μg/g。一般配方奶粉中添加葉黃素通常不少于0.10 μg/g，故此檢出限完全可以滿足日常樣品的分析要求。標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的色譜如圖1所示，光譜掃描圖如圖2所示。

2.4 回收率與精密度實驗

選取空白奶粉作為加標(biāo)試驗研究對象。稱取10.0 g奶粉樣品若干份，加標(biāo)水平分別為0.50，1.00，5.00 μg/g三個水平，每個加標(biāo)水平平行實驗5次，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。實驗步驟為按1.4方法處理,實驗結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，葉黃素的平均回收率為96.8%～98.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.27%～6.73%，可以滿足分析要求。

表1 回收率及精密度試驗結(jié)果(n=5)

由表1可以看出，本方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，完全可以滿足分析要求。

2.5 實際試樣的測定

采用本方法對市售的7批次配方乳粉中葉黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示。

表2 試樣的測定結(jié)果

2.6 葉黃素的穩(wěn)定性

葉黃素對光、熱敏感，樣品處理不當(dāng)容易導(dǎo)致樣品中葉黃素被氧化，測定結(jié)果偏低。因此，在整個試驗過程中應(yīng)盡量密封、避光，在前處理前先添加適量的抗壞血酸作為抗氧化劑，同時本研究采用空白加標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

本文建立了一種測定配方乳粉中葉黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法，采用Diamonsil C18色譜柱（5μm，250 mm× 4.6 mm），流動相為甲醇-水（97∶3），流速1.0 mL/min,檢測波長445 nm，采用空白加標(biāo)試驗繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法在0.5～100 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R=0.9987）,加標(biāo)水平為0.50，1.00,5.00 μg/g時，回收率分別介于96.8%～98.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差介于4.27～6.73%之間，該方法檢測限低于0.10 μg/g。實驗結(jié)果表明，該方法操作簡便，靈敏度高、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，適合于配方奶粉中葉黃素的檢測。

[1]黃聲嵐，俞曉玲，柯加法，等.高效液相色譜法測定食品中的葉黃素[J].海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2009,15(4):48-50.

[2]石晉，欒雨時，王靜云，等.HPLC法測定甘薯葉片中的黃素[J].植物研究,2008,28(6):767-769.

[3]曹洪昭，聶傳平，李紅玉.HPLC法測定萬壽菊莖中葉黃素的含量[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2010,23(2):197-199.

[4]李寧，張雪霞，崔彥，等.HPLC同時測定萬壽菊花中葉黃素及玉米黃素的含量[J].中國新藥雜志,2006,15(16):1381-1382.

[5]陳佩，羅季陽，田呈瑞.反相高效液相色譜法同時測定胡蘿卜汁中的α，β-胡蘿卜素和葉黃素[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(5):32-33..

[6]章清，沈新南，劉珊林.高效液相色譜法測定血清葉黃素、番茄紅素和β-胡蘿卜素[J].營養(yǎng)學(xué)報,2009,31(5):498-500.

[7]黃小春，吳靈英，邱銀生，等.用高效液相色譜法快速測定蛋黃中的葉黃素[J].飼料廣角,2007,13:37-39.

Determination of lutein in milk powder by HPLC

WANG Jin,CHEN Wan-qin,CHEN Xiao-zhen，ZHANG Dong-lei
(Zhejiang Test Academy of Quality and Technical Supervision，Hangzhou 310013，China)

A HPLC method for determination of lutein in milk powder.The analysis was carried on a Diamonsil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）column,the mobile phase was methanol-water(97∶3),the flow-rate was set at 1.0 mL·min-1,chromatographic runs were montitored at 445 nm.When analyzing samples under the same conditions,draw matrix calibration curves.The results showed that the linearity of the method was good between 0.5～100 mg/L(R=0.9987).The recoveries were in the range from 96.8%to 98.4%at the spiked levels of 0.50，1.00，5.00 μg/g，and the relative standard deviation were between 4.27%～6.73%in different concentration level.The limit of detection was 0.10 μg/g.The method is simple,sensitive,accurate and precise for determination of lutein in milk powder.

Lutein；high performance liquid chromatography；milk powder

TS252.7

A

1001-2230（2012）03-0060-02

2011-11-03

王瑾（1978-），女，工程師，從事食品質(zhì)量安全檢測研究。