試劑盒法測定乳粉中的維生素

王旻

（1.東北農業(yè)大學，哈爾濱 150030;2.黑龍江省乳品工業(yè)技術開發(fā)中心，哈爾濱 150086）

試劑盒法測定乳粉中的維生素

王旻1,2

（1.東北農業(yè)大學，哈爾濱 150030;2.黑龍江省乳品工業(yè)技術開發(fā)中心，哈爾濱 150086）

通過對國家標準GB 5413-2010和德國拜法公司微生物法測維生素試劑盒說明書的研究，做對比試驗，兩種檢測方法差異率小于10%。找出試劑盒標準曲線的實際質量分數(shù)，繪制出標準曲線，定出實驗室適用的試劑盒方法。

微生物法,檢測；維生素；試劑盒

0 引言

微生物法測定食品中的維生素，源于美國官方分析家協(xié)會手冊（AOAC）[1]。鑒于國標修改需要大量的數(shù)據(jù)支持，所以新國標GB5413-2010也是等同采用AOAC方法只是格式和適用條件變化一些。該方法多年來原理未改動，雖然有這樣或那樣的自動化測定設備的改進，但都操作復雜，成本高，對人員、器皿清洗要求高。受德國必發(fā)公司的試劑盒方法啟示，本文也研究了利用試劑盒測定乳粉中的維生素。

1 實驗

1.1 材料

不同種類奶粉及米粉，96微孔板(NUNC滅菌)，1.5 mL微型離心管(microtube),0.22 μm濾膜（密理博）, 5 mL注射器,維生素B12測定培養(yǎng)基（Difco）,生物素測定培養(yǎng)基（Difco）,葉酸測定培養(yǎng)基（Difco）,,乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（Difco），乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（Difco）。

1.2 菌株

（1）維生素B12測定用菌種：萊曼氏乳桿菌（Lactobacillus leichamanni）(ATCC7830)

（2）生物素測定用菌種：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）(ATCC8014)

（3）葉酸測定用菌種：干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）(ATCC7469)

菌株來源于美國標準菌種保藏中心（ATCC），現(xiàn)保存于東北農業(yè)大學。

1.3 主要設備

電熱滅菌壓力鍋，超純水機，pH計，生化培養(yǎng)箱，微孔板判讀儀(540～550nm或610～630nm)，離心機，水浴鍋。

1.4 方法

1.4.1 測試菌株的制備

從冷藏的乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基接種管中接種一管乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h在無菌條件下離心該培養(yǎng)液10 min（2 000 r/min），傾去上清液，再用10 mL生理鹽水振蕩洗滌菌體，再離心10 min（2 000 r/min），傾去上清液，再用另外的10 mL生理鹽水清洗。如前面一樣離心，棄去上清液，再加10 mL生理鹽水。吸1 mL該菌懸液于10 mL生理鹽水中，混合均勻。萊曼氏乳桿菌（Lactobacillus Leichamanni）用于維生素B12測定；干酪乳桿菌（Lactobacillus Casei）用于葉酸測定；植物乳桿菌（Lactobacillus Plantarum）用于生物素測定[1-2]。

1.4.2 樣本處理

（1）維生素B12和生物素測定。稱取1 g樣品(維生素B12含量大約0.01 μg；生物素含量大約0.3 μg)加入40 mL水，在水浴鍋中90℃保持30 min，冷卻至室溫后吸取1 mL到1.5 mL離心管中，用0.22 μm濾膜過濾除菌[2]或者在滅菌壓力鍋中，加熱到115℃保持10 min。然后用蒸餾水稀釋到適宜的倍數(shù)。然后用加樣槍加150 μL到微孔板中和等量的已混入適宜濃度菌液的維生素B12或生物素測定培養(yǎng)基混合[7-8]。

（2）葉酸的測定。磷酸緩沖溶液的配制：7.8 g磷酸氫二鈉和1 g抗壞血酸溶于1 000 mL用40%氫氧化鈉溶液調pH值至7.2。稱取1 g樣品(葉酸含量大約0.5 μg)加入40 mL磷酸緩沖溶液，在水浴鍋中90℃保持30 min，冷卻至室溫后吸取1 mL到1.5 mL離心管中，用0.22 μm濾膜過濾除菌[3]或者在滅菌壓力鍋中，加熱到115℃保持10 min。然后用蒸餾水稀釋到適宜的倍數(shù)。然后用加樣槍加150 μL到微孔板中和等量的已混入適宜濃度菌液的葉酸測定培養(yǎng)基混合[6]。

1.4.3 標準溶液的制備

建立小鼠肝轉移模型［11］，動物實驗結果顯示，在miR-454-3p mimics轉染組中，小鼠的肝轉移灶數(shù)量顯著高于陰性對照組。小鼠的肝轉移灶為箭頭所指示處，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)組間差異顯著，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖5）。

(1)維生素B12標準溶液。維生素B12標準曲線上5個點的質量分數(shù)分別為0.03%，0.06%，0.12%，0.18%。

(2)生物素標準溶液。生物素標準曲線上5個點的質量分數(shù)分別為0.08、0.24%，0.40%，0.56%，0.72%。

(3)葉酸標準溶液。葉酸標準曲線上5個點的質量分數(shù)分別為0.18%，0.32%，0.64%，0.96%，1.28%。

1.4.4 培養(yǎng)

每孔先加入150 μL混入菌液的培養(yǎng)基，然后分別加入150 μL樣品和標準曲線溶液到試劑盒中。試劑盒放入（36±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)24～48 h[6-8]。

1.4.5 測定

測定前反復翻轉試劑盒混勻樣液。酶聯(lián)免疫測定儀波長設定到630 nm[2]，振蕩5 s，讀取每孔的數(shù)值（吸收值A）。

2 結果與討論

2.1 結果

曲線吸收值×稀釋倍數(shù)×100維生素質量分數(shù)=樣品質量

式中：曲線吸收值需分別從下面三項標準曲線中查出。曲線橫坐標X軸表示維生素質量分數(shù)單位是μg/ 100 g；縱坐標Y軸表示酶聯(lián)免疫讀數(shù)儀讀取微孔板樣品的光密度（濁度）A值。%圖1為維生素B12標準曲線；圖2為生物素標準曲線；圖3為葉酸標準曲線。4種乳粉中維生素B12質量分數(shù)、生物素質量分數(shù)、葉酸質量分數(shù)可以從標準曲線圖1～圖3中查出。

分別用試劑盒法和國標法測試4種不同類型的某品牌奶粉。國標法由于樣品處理步驟較多請詳見標準GB 5413-2010[3-5]。3項結果如表1～表3所示。

表1 維生素B12計算結果μg/100g

表2 生物素計算結果μg/100g

表3 葉酸計算結果μg/100g

2.2 討論

從測定結果看，試劑盒方法比國標方法略高一些。這是由于前處理方法不同引起的，國標方法121℃，5 min滅菌，同時也是現(xiàn)有條件決定的。如果采取115℃滅菌可能后期培養(yǎng)過程中會被雜菌干擾，標線和樣品管會沒有生長梯度。試劑盒方法用115℃，10 min滅菌，也能達到無菌水平，培養(yǎng)24～48 h對目標菌沒有影響。由于所測奶粉類樣品多數(shù)是強化維生素，其所含有的內源天然維生素含量較低與后強化的維生素含量比較比例很低。國標方法用酸或酶水解目的就是水解樣品中的天然維生素，而試劑盒方法沒有，但從實測結果看影響不大。國標方法源于AOAC方法，而AOAC方法適用更廣泛食品類樣品，本文所討論的乳粉類樣品用此試劑盒方法是適用的。

（1）節(jié)省成本。試劑盒方法由于培養(yǎng)基用量較少可以預先把適宜濃度菌液混入測定培養(yǎng)基混勻，比國標方法逐管加菌液要均勻、省力、省時、合理，而且減少污染的幾率，提高實驗成功率。微生物法測維生素所用的測定培養(yǎng)基，都是國外質量過關穩(wěn)定的產品，國內有資質的實驗室都選用進口產品，但是其價格高昂。例如葉酸項目所用的葉酸酪蛋白培養(yǎng)基一瓶重量100 g，每9.4 g配制100 mL溶液，價值1 000元左右。按照國標方法，每個樣品用12個試管，每管5 mL計算只能作17個樣品，這還不包括標準曲線所用的量。試劑盒方法每孔只用150 μL，每個樣品只用三孔或二孔作平行，每瓶培養(yǎng)基能作2364個樣品。由于所加樣液很少在稀釋的過程中可用一次性1.5 mL的離心管和加樣槍替代體積較大的容量瓶、試管和移液管等，既節(jié)省了純水有節(jié)省了人工。現(xiàn)在一小時可以完成國標法8 h的工作量。

（2）測定時間。國標方法所用的光密度法如果用分光光度計測8 h可以測20個樣品，即使用最先進的濁度測定儀也只能每次最多測12樣品。試劑盒法所用的96孔板若加上標準曲線孔，最多可作26個樣品，用酶聯(lián)免疫讀數(shù)儀幾秒就可以讀取所有數(shù)據(jù)。

3 結論

以國標方法為基準，試劑盒法與國標方法相比較，檢測上述4種不同類型乳粉結果影響在合理范圍而且大量節(jié)省試劑成本，節(jié)省人工勞動，大大縮短測定時間。所以差異率小于10%，方法可用。

[1]AOAC Official Method 944.12 Folic Acid(Pteroylglutamic Acid)in Vitamin preparations Microbiological Methods First Action 1944 Final Action 1960[S].

[2]AOAC Official Method 952.20 Cobalamin(Vitamin B12)in Vitamin Preparations Microbiological Methods First Action 1952 Final Action 1960[S].

[3]中華人民共和國國家標準GB 5413.19-2010食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定[S].

[4]中華人民共和國國家標準GB 5413.16-2010食品安全國家標準《嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測定》[S].

[5]中華人民共和國國家標準GB 5413.14-2010食品安全國家標準《嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定》[S].

Kit method for the determination of the vitamin in milk powder

WANG Min1,2
（1.Northeast Agricultural University，Harbin 150030,China 2.Heilongjiang Dairy Industry and Tecnology Developing Centre Harbin 150086,China）

Study methods of reference of P.R.China(GB5413-2010)and manuals of R-Biopharm of Germany.Compared to test two methods,Find the concentration of standards of kits and drawing the curve of standards.Work out the methods of kits for lab.

microbiological method；determination；Vitamin；kits

TS252.7

A

1001-2230（2012）03-0057-03

2012-01-10

王旻(1971-),男，碩士研究生，從事乳品檢驗方面的研究。