酶解酪蛋白制備易于消化吸收肽的工藝研究

王彩云，荊瑩，石丹，云戰(zhàn)友

（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，呼和浩特 010080)

酶解酪蛋白制備易于消化吸收肽的工藝研究

王彩云，荊瑩，石丹，云戰(zhàn)友

（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，呼和浩特 010080)

為了提高酪蛋白的消化吸收利用率，利用胰蛋白酶對酪蛋白進(jìn)行水解改性，制備易消化吸收的肽。通過對水解工藝的研究，得到了胰蛋白酶水解酪蛋白的優(yōu)化工藝條件：E/S為14 000 U/100 mL，溫度為50℃，pH值為8，水解時間為2.5 h，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%。利用此工藝得到的酪蛋白水解物的水解度為7.6%，水解物中分子量在2 000～180 u的肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)占80%，其中1 000～180 u的水解物占總水解物的59%。

胰蛋白酶；酪蛋白；水解度；分子量分布

0 引言

酪蛋白是牛乳蛋白的一種主要成分，在牛奶中與乳清蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之比接近80∶20[1]。當(dāng)酪蛋白進(jìn)入胃內(nèi)與胃液混合后形成較大凝塊且堅硬，不易被消化吸收。已有研究表明酪蛋白經(jīng)酶水解后生成低分子量的小肽，有利于人體對酪蛋白的消化吸收。這是由于蛋白質(zhì)完全水解后，在相同濃度下，相同氨基酸組成的肽比游離氨基酸吸收速度快[2，3]。動物所能吸收的肽主要是由10個以下氨基酸殘基構(gòu)成的寡肽（1 000～180 u）,尤其是小肽(二肽、三肽)[4]。因此，從消化吸收的角度考慮，理想的酶解產(chǎn)物以寡肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)較多為宜。

本研究采用胰蛋白酶對酪蛋白進(jìn)行水解，以獲得寡肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高、而游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對較少的酪蛋白水解產(chǎn)物。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

胰蛋白酶(Trypsin)，酪蛋白（Casein），其他試劑均為優(yōu)級純或分析純。

1.2 儀器

紫外-可見分光光度儀（756PC型）；電子天平（BP211D型）；自動電位滴定儀（785MP型）；冷凍水浴恒溫振蕩器（LSHZ-300型）；凱氏定氮儀（B324型）；微電腦變頻電磁爐（C-01型）。

2 方法

2.1 水解工藝

8%的酪蛋白溶液→用氫氧化鈉將pH值調(diào)至適宜值→將樣品置于振蕩水浴鍋里，待樣品溫度升至酶解溫度時加酶，混勻，水解，搖床轉(zhuǎn)速為80 r/min→定時取樣→沸水浴滅酶活10 min→檢測

2.2 檢驗(yàn)方法

酶活力的測定采用紫外分光光度法測定蛋白酶的活力[5]；水解度（DH）的測定采用三硝基苯磺酸法(Trinitrobenzene sulfonicacid，TNBS)[6-7]；肽分子量分布測定[8]采用高效液相色譜方法測水解產(chǎn)物的分子量分布。

2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計[9]

2.3.1 最適酶解時間

將酪蛋白溶液的pH值固定至8.00，固定酶和底物濃度比為10 000 U/100 mL，固定酶解溫度為55℃，分別在不同酶解時間條件下對酪蛋白進(jìn)行水解，滅酶活，測定水解度、分子量分布，以分子量分布為指標(biāo)確定最適酶解時間。

2.3.2 最適pH值

酶解時間采用2.3.1中方法，確定的最適酶解時間，固定酶和底物濃度比為10 000 U/100 mL，，固定酶解溫度為55℃，分別在適當(dāng)?shù)牟煌琾H值下對酪蛋白進(jìn)行水解，滅酶活，測定水解度、分子量分布，以分子量分布為指標(biāo)確定最適pH值。

2.3.3 最適酶解溫度

采用2.3.1和2.3.2中所確定的最適酶解時間和最適pH值，固定酶和底物濃度比，分別在適當(dāng)?shù)牟煌瑴囟认聦业鞍走M(jìn)行水解，滅酶活，測定水解度、分子量分布，以分子量分布為指標(biāo)確定最適酶解溫度。

2.3.4 最適酶和底物濃度比

采用2.3.1，2.3.2和2.3.3中所確定的最適酶解時間、最適pH值和最適酶解溫度，分別在不同酶和底物濃度比條件下對酪蛋白進(jìn)行水解，滅酶活，測定水解度、分子量分布，以分子量分布為指標(biāo)確定最適酶和底物濃度比。

2.3.5 酶解最優(yōu)工藝條件的確定

以分子量分布為考察指標(biāo)。對水解條件進(jìn)行優(yōu)化。確定酶解的最佳工藝。對水解溫度、pH值、酶與底物濃度比（E/S）、反應(yīng)時間進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)。分子量分布為2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。因素和水平排列如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)果與分析

3.1 原料測定

3.1.1 胰蛋白酶活性的測定

以酪氨酸溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)的275 nm下的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制線性回歸曲線，得回歸方程為A=0.0074C+0.0093，R2=0.9998。如圖1所示。

通過酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出胰蛋白酶和堿性蛋白酶的酶活力為23 027 U/g。

3.1.2 酪蛋白指標(biāo)分析

對原料酪蛋白各項(xiàng)成分檢測結(jié)果如表2所示。

表2 酪蛋白成分檢測結(jié)果%

3.2 最適酶解時間

圖2為酶解時間對分子量分布和水解度的影響。由圖2可以看出，在酶解過程中，隨著酶解時間的延長，酶解液水解度逐漸升高，在酶解進(jìn)行到120 min時達(dá)到最高，之后隨著酶解時間的延長，水解度略有降低并趨于平緩。從分子量分布來看，在酶解過程中，隨著酶解時間的延長，酶解液中大分子量的產(chǎn)物逐漸減少，但是在240 min的水解過程中，各個時間段內(nèi)分子量在1 000～180 u的酶解產(chǎn)物分布相對穩(wěn)定，均在27%～29%之間。因此綜合考慮分子量分布及水解度等因素擬定最適酶解時間為120 min。

3.3 最適pH值

圖3為pH值對分子量分布和水解度的影響。由圖3可以看出，當(dāng)初始pH值為8.00時，酶解產(chǎn)物的水解度達(dá)到最大值；酶解初始pH值為8.00時，酶解產(chǎn)物的分子量在1 000～180 u的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較多，而小于180 u的游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。因此，擬定的酶解初始pH值為8.00。

3.4 最適酶解溫度

眾所周知，在蛋白酶酶解過程中有一個最適的反應(yīng)溫度，在一定范圍內(nèi)升高溫度，底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的速度加快，酶解效率也相應(yīng)提高，表現(xiàn)在水解度上則呈增加趨勢。但是如果溫度過高，或者過低都不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行。由圖4可以看出，酶解溫度在50℃到55℃時，酶解產(chǎn)物水解度保持一個較高的水平，而當(dāng)酶解溫度超過55℃，酶解產(chǎn)物水解度開始下降。從分子量分布來看，酶解溫度為52.5℃時，酶解產(chǎn)物的分子量在2 000～180 u質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，大于10 000 u和小于180 u的水解物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少。因此，擬定的酶解溫度是52.5℃。

3.5 最適酶和底物濃度比

圖5為酶與底物的比對分子量分布和水解度的影響。由圖5可以看出，在E/S=12 000時，酶解產(chǎn)物的水解度最大。由分子量分布可知在E/S=12000時，酶解產(chǎn)物在分子量段為2 000～180 u的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，大于10 000 u的質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏低，小于180 u的居中。因此，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果酶與底物濃度比確定為12 000 U/ 100 mL。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，單因素確定的水解條件：時間為2 h，pH值為8.00，溫度為52.5℃，E/S=12 000。

3.6 酶解最優(yōu)工藝條件的確定

通過單因素試驗(yàn)，得到各因素的最佳值，從而確定每個因素的最佳使用區(qū)域，并通過正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計如表3所示；極差分析結(jié)果如圖6所示。

根據(jù)極差R的大小來確定各因子影響指標(biāo)的主次順序，由表4結(jié)合極差分析圖6可以看到各因子的極差R的大小依次為C＞B＞D＞A，因此各因素的影響排列順序依次為溫度＞pH值＞E/S＞時間。

由于方案設(shè)計以分子量分布在1000～180u的水解物為目標(biāo)，因此，得到工藝的最優(yōu)方案為A3B2C1D3，對應(yīng)的水解條件為：時間2.5 h、pH值8、溫度50℃、E/S為14 000，即正交實(shí)驗(yàn)中8號方案。該條件下對應(yīng)的水解度為7.6%。

表3 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)，以水解物分子量在180～1 000 u的小肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為指標(biāo)，確定了胰蛋白酶水解酪蛋白的最優(yōu)工藝：水解溫度為50℃，E/S為14 000， pH值為8，水解時間為2.5 h。此時，胰蛋白酶水解酪蛋白的水解度為7.6%，酶解產(chǎn)物主要是分子量在180～2 000 u的多肽，占到總水解物的80%，而分子量180～1 000 u的寡肽占到59%，游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少，適合人體的消化吸收。該酪蛋白水解工藝的建立，為酪蛋白水解肽的應(yīng)用開發(fā)進(jìn)一步奠定了基礎(chǔ)。

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Study on the technology for hydrolysis of casein for digestion and absorption of peptides

WANG Cai-yun,JING Ying,SHI Dan,YUN Zhan-you
(Inner Mongolia Yili Industrial Group.,Co Ltd,Technoligy Center,Hohhot 010080,China)

In order to improve digestion and absorption of casein,casein hydrolysate was prepared by trypsin,it is easy to digest and absorb. The conditions of hydrolized casein by the trypsin were studied and found that optimize the parameters were as follows:enzyme to substrate ratio(E/S)14 000 U/100 mL,temperature 50℃,pH in the beginning 8,hydrolysis time 2.5 h,mass fraction of substrate 8%.Under the optimum conditions of the trypsin hydroyzate of casein,degree of hydrolysis was 7.6%,mass fraction of molecular weight 2 000～180 was 80%, mass fraction of molecular weight 1 000～180 was 59%.

trypsin；casein；degree of hydrolysis；molecular weight distribution

Q936

A

1001-2230（2012）03-0018-04

2011-10-17

國家十一五科技支撐計劃資助項(xiàng)目(2006BAD04A06)。

王彩云（1979-），女，碩士研究生，從事乳品工藝研發(fā)工作。