谷氨酰胺對內(nèi)毒素血癥新生幼鼠腸道功能保護(hù)作用的研究

苗士建 張 燁 黃 瑛 陳 蓮

谷氨酰胺(Gln)是人體內(nèi)含量最豐富的氨基酸，占總游離氨基酸的50%[1]，通常情況下Gln較易合成，并且儲存在骨骼肌中，同時肝臟、肺和腦也可制造較少量Gln[2]。但在器官或組織需求過度的情況下，如敗血癥或其他分解代謝應(yīng)激等條件下，機(jī)體對Gln利用增加，血中Gln水平明顯下降，不足以滿足腸道、免疫系統(tǒng)、肝臟和腎臟等需求的增加,因此需補(bǔ)充外源性Gln[3]。新生兒尤其是危重癥新生兒，在出生后數(shù)周內(nèi)很難達(dá)到全腸道喂養(yǎng)，在目前常規(guī)使用的靜脈營養(yǎng)液中也缺乏Gln。動物研究顯示，在Gln喪失的情況下，可致大鼠腸黏膜明顯破壞[4]。多項(xiàng)研究證明補(bǔ)充Gln可顯著降低感染性疾病的發(fā)生率，改善營養(yǎng)狀況和重要器官的功能[5～11]。

本課題組前期研究[12]發(fā)現(xiàn)，Gln對受到脂多糖(LPS)刺激的腸道Caco-2細(xì)胞具有顯著保護(hù)作用，本研究擬從動物水平對Gln的保護(hù)作用進(jìn)一步研究，建立內(nèi)毒素血癥新生幼鼠模型，觀察Gln干預(yù)后幼鼠腸上皮細(xì)胞膜完整及流動性情況，腸上皮絨毛和微絨毛結(jié)構(gòu)的改變情況，初步探討Gln對內(nèi)毒素血癥幼鼠腸道功能的保護(hù)作用，為危重病患兒的營養(yǎng)支持提供更多理論依據(jù)。

1 方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD大鼠母鼠及其新生幼鼠共4窩，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)每窩幼鼠(10±2)只，體重(6.20±0.17)g。復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 試劑 ①蛋氨酸亞砜胺(MS)(美國Sigma公司)，使用無菌注射用水配成25 g·L-1母液，4℃保存。②腹腔注射用Gln(商品名：麥滋林-S，含L-Gln 663.3 mg·670 mg-1,日本壽制藥株式會社)，使用無菌注射用水配成100 g·L-1母液，常溫下保存。③LPS(EcoliO55∶B5，美國Sigma公司)，使用無菌注射用水配成0.5 g·L-1母液，4℃保存。④ELISA試劑盒：大鼠IL-1β、大鼠趨化性細(xì)胞因子(MCP-1，Biosource公司)，大鼠TNF-α(R&D公司)。⑤Gln標(biāo)準(zhǔn)品(G3202,CAS 327-57-1,美國Sigma公司)使用去離子水配成1 mmol·L-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后稀釋成50、100、150、200、300、600和1 000 μmol·L-1系列溶液，4℃保存。

1.3 內(nèi)毒素血癥幼鼠模型的建立和干預(yù)方法 自然分娩母鼠及其幼鼠均在清潔動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)3 d，母鼠正常飼養(yǎng)，幼鼠母乳喂養(yǎng)，每1窩為一組，隨機(jī)分為：①M(fèi)S+NS組：母鼠和幼鼠給予MS +幼鼠給予NS；②MS+Gln組：母鼠和幼鼠給予MS+幼鼠給予Gln；③正常喂養(yǎng)+Gln組：幼鼠正常母乳喂養(yǎng)(母鼠和幼鼠均不給予MS)+幼鼠給予Gln；④正常喂養(yǎng)+NS組：幼鼠正常母乳喂養(yǎng)(母鼠和幼鼠均不給予MS)+幼鼠給予NS。各組均在母鼠分娩第3天和幼鼠出生第3天起開始干預(yù)，均連續(xù)給予6 d。MS,Gln和NS均采用腹腔注射，注射劑量分別為MS 100 mg·kg-1·d-1，Gln 10 mL·kg-1·d-1，NS 10 mL·kg-1·d-1。各組幼鼠均于實(shí)驗(yàn)第7天(即生后第10天)腹腔注射LPS 10 mL·kg-1。

1.4 樣本制備 腹腔注射LPS后6 h頸椎脫臼法處死幼鼠，心臟采血法采血0.3～0.5 mL。游離腸道，取距回盲部約12 cm處近端長約10 cm的完整小腸組織，冰NS灌注并清除小腸內(nèi)容物后，沿系膜縱行剪開。在新鮮小腸標(biāo)本上沿腸系膜緣及對側(cè)緣縱向取長約1.5 cm、寬約0.5 cm腸壁組織，備用行光鏡和電鏡觀察。刮取標(biāo)本剩余腸黏膜50～100 mg，制成勻漿液備用，以測定細(xì)胞因子表達(dá)水平。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 體重增加量 采用TCS-500型電子稱(武漢電子稱重儀器公司)對幼鼠每天稱重，計(jì)算實(shí)驗(yàn)第1天(干預(yù)前)和第7天處死前的體重增加量，體重精確至0.01 g。

1.5.2 血漿Gln濃度 新生幼鼠血液離心取血漿，采用安捷倫1100液相色譜儀 (美國安捷倫科技有限公司)測定Gln濃度。熒光激發(fā)波長為340 nm，發(fā)射波長為450 nm，紫外檢測波長為338 nm。

1.5.3 腸上皮細(xì)胞細(xì)胞膜流動性水平[13]制備腸上皮細(xì)胞細(xì)胞膜懸液[14]，加入等體積DPH 探針，采用Schimadzu RF2600型熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)測定熒光偏振度(Pr) 。激發(fā)波長為362 nm,發(fā)射波長為432 nm,狹縫寬度為5 nm。

1.5.4 腸黏膜組織勻漿液細(xì)胞因子水平 腸黏膜組織勻漿液在冰壺上離心，取上清于-70℃保存。按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行各組腸黏膜的MCP-1、TNF-α和IL-1β水平測定。

1.5.5 腸黏膜組織光鏡和電鏡觀察 每只幼鼠均取新鮮腸壁組織2塊，切片行蘇木精-伊紅染色，在復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院病理科專業(yè)人員指導(dǎo)下行光鏡觀察腸黏膜損傷情況；同時各取2塊新鮮腸壁組織分別進(jìn)行透射電鏡(日立S-520型)和掃描電鏡(飛利浦CM-120)，在復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院電鏡室專業(yè)人員指導(dǎo)下觀察腸黏膜絨毛和微絨毛的完整度。

2 結(jié)果

2.1 死亡率 MS+Gln組、MS+NS組、正常喂養(yǎng)+Gln組和正常喂養(yǎng)+NS組出生幼鼠分別為11、11、10和11只，MS+Gln組和MS+NS組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前分別死亡2(18.2%)和6只(54.5%)。

2.2 體重增加量 表2顯示，組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。兩兩比較顯示，除正常喂養(yǎng)+Gln組和正常喂養(yǎng)+NS組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.084)，余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.3 血漿Gln濃度 表2顯示，組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。兩兩比較顯示，除正常喂養(yǎng)+Gln組和正常喂養(yǎng)+NS組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.066)，余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.4 腸上皮細(xì)胞細(xì)胞膜流動性 表1顯示，組間熒光偏振度總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014)。兩兩比較顯示，除正常喂養(yǎng)+Gln組和正常喂養(yǎng)+NS組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P=0.073)，余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.5 腸黏膜組織勻漿液細(xì)胞因子水平 表1顯示，組間MCP-1、TNF-α和IL-1β總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.015、0.011和0.003)。兩兩比較顯示，MCP-1、TNF-α和IL-1β水平除正常喂養(yǎng)+Gln組和正常喂養(yǎng)+NS組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P分別為0.063、0.079和0.052)，余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 各組幼鼠體重增加量、血漿Gln濃度、細(xì)胞膜流動性和細(xì)胞因子水平比較

Notes Overall, the between-group differences in weight gain, plasma Gln concentration, IEC membrane fluorescence polarization and IL-1βexpression of baby rats were significantly different (P<0.05). There was no statistical difference among normal+Gln group and normal +NS group (P>0.05); but among the other groups, there was statistical difference

2.6 腸黏膜病理學(xué)改變

2.6.1 光鏡觀察 MS+NS組可見絨毛變短小，排列極其紊亂，有明顯的斷裂脫落(圖1A)；MS+Gln組腸黏膜絨毛有不同程度的變短，排列雜亂，黏膜結(jié)構(gòu)有不同程度破壞，但較MS+NS組損傷程度輕，亦有觀察到低水平的絨毛修復(fù)(圖1B)；正常喂養(yǎng)+Gln組及正常喂養(yǎng)+NS組腸絨毛均有不同程度的排列紊亂和變短，但較MS+NS組損傷程度輕(圖1C,D)。

2.6.2 透射電鏡 MS+NS組可見腸微絨毛排列極其雜亂，長度縮短，斷裂明顯，且腸上皮細(xì)胞絨毛膜欠完整，細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹和破裂明顯(圖2A)；MS+Gln組亦可見微絨毛排列雜亂，長度縮短，部分有斷裂，腸上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體明顯腫脹(圖2B)；正常喂養(yǎng)+Gln組及正常喂養(yǎng)+NS組腸微絨毛長度、寬度正常均一，排列較整齊，少見斷裂，腸上皮細(xì)胞膜相對完整，無明顯線粒體腫脹(圖2C,D)。

2.6.3 掃描電鏡 MS+NS組可見腸黏膜表面絨毛斷裂缺損，脫落明顯，絨毛頂端微絨毛嚴(yán)重剝脫(圖3A)；MS+Gln組腸黏膜絨毛斷裂缺損，絨毛頂端微絨毛有一定程度的剝脫(圖3B)；正常喂養(yǎng)+Gln組及正常喂養(yǎng)+NS組腸黏膜表面絨毛輕度斷裂，無明顯脫落，絨毛頂端微絨毛尚完整(圖3C,D)。

圖1 各組幼鼠腸黏膜光鏡下觀察結(jié)果(蘇木精-伊紅染色, ×20)

Fig 1 Findings under light microscopy(HE staining, ×20)

Notes A: MS+NS group, the intestinal structure was not intact, small intestine villi were the shortest and badly destroyed under optical microscopy; B: MS+Gln group, the intestinal structure was also not intact, small intestine villi were short and destroyed, but some of them were restored; Normal+Gln (C) and Normal+NS (D) group, small intestine villi were slightly destroyed

圖2 各組幼鼠腸黏膜透射電鏡觀察(×10 000)

Fig 2 Findings under transmission electron microscopy(×10 000)

Notes A: MS+NS group, small intestine microvilli were the shortest, badly abrupt and disorderly arranged, the membranes were destroyed and mitochondrion were obviously ruptured; B: MS+Gln group, small intestine microvilli were shorter and disorderly arranged, the membranes were destroyed and mitochondrion were obviously swollen; Normal+Gln (C) and Normal+NS (D) group, small intestine microvilli were normally arranged and not obviously ruptured, the membranes were not destroyed

圖3 各組幼鼠腸黏膜掃描電鏡觀察(×10 000)

Fig 3 Findings under scanning electron microscopy(×10 000)

Notes A: MS+NS group, small intestine microvilli were the shortest, badly abrupt and disorderly arranged, the membranes were destroyed and mitochondria were obviously ruptured; B: MS+Gln group, small intestine microvilli were shorter and disorderly arranged, the membranes were destroyed and mitochondria were obviously swollen; normal+Gln (C) and normal+NS (D) group, small intestine microvilli were normally arranged and not obviously ruptured, the membranes were not destroyed

3 討論

本研究給予LPS注射后幼鼠腸黏膜組織發(fā)生明顯改變，腸黏膜細(xì)胞因子水平增加,光鏡下可見腸絨毛均有排列紊亂和變短變窄,同時電鏡亦觀察到腸上皮細(xì)胞線粒體腫脹,空泡樣改變明顯,微絨毛排列不整、斷裂等明顯損傷,證明LPS對腸黏膜的損傷和內(nèi)毒素血癥模型的成功建立。有研究[15,16]在Gln對內(nèi)毒素血癥幼鼠腸黏膜損傷的保護(hù)作用的研究中，構(gòu)建的內(nèi)毒素血癥幼鼠腸黏膜同樣表現(xiàn)為炎癥損傷，形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能受損，與本研究一致。本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)于實(shí)驗(yàn)第1天給予幼鼠LPS，但各組幼鼠死亡率均較高，且同時給予MS幼鼠死亡率更高，無法完成實(shí)驗(yàn)。考慮到新生幼鼠出生1周內(nèi)生存能力較差，結(jié)合前期研究結(jié)果，本研究于實(shí)驗(yàn)第7天給予LPS。

目前國外研究Gln缺乏的動物模型主要采用Li等[16]建立的“pup-in-the-cup”大鼠模型，國內(nèi)研究也多采用類似管飼法建模[17～19]。該模型將新生鼠脫離母鼠喂養(yǎng)，胃造瘺后管飼，通過管飼低Gln或不含Gln的代乳品飲食，造成Gln濃度變化，從而觀察Gln能否減輕LPS誘導(dǎo)的新生大鼠腸道的炎癥反應(yīng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)采用“pup-in-the-cup”模型經(jīng)人工胃造瘺后管飼的方法喂養(yǎng)，喂養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作過程較復(fù)雜，實(shí)施有一定難度，且胃造瘺對大鼠機(jī)體創(chuàng)傷較大，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有一定影響。故本研究給予母鼠及幼鼠腹腔內(nèi)注射MS，結(jié)果顯示MS+NS組血漿Gln濃度明顯下降，提示MS能抑制Gln合成酶，導(dǎo)致體內(nèi)Gln合成障礙，在給予MS抑制且不給予母乳喂養(yǎng)的情況下，幼鼠的內(nèi)源性和外源性來源的Gln同時受到抑制，造成Gln缺乏。給予MS抑制的兩組幼鼠血漿Gln濃度均顯著低于正常母乳喂養(yǎng)的兩組，提示在內(nèi)源性來源受到抑制時，幼鼠主要依賴從母乳中攝取外源性Gln，雖然產(chǎn)后母鼠的乳汁無法直接獲取以檢測Gln濃度，文獻(xiàn)中亦未檢索到有關(guān)母鼠乳汁Gln濃度的研究，但根據(jù)本研究中給予母乳喂養(yǎng)的兩組幼鼠血漿Gln濃度明顯高于給予MS的兩組，推測給予母鼠MS會影響乳汁中Gln濃度。本研究建立的模型為幼鼠處于自然的母鼠喂養(yǎng)條件下，在操作上更加方便可行，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣驗(yàn)證造模成功，有利于今后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行Gln的相關(guān)研究。

本研究采用不同的干預(yù)方法造成幼鼠不同程度的Gln缺乏，MS+NS組作為Gln完全缺乏組，幼鼠體重增加緩慢，死亡率較高，添加Gln后(MS+Gln組)則體重有明顯增加，死亡率下降，而正常母乳喂養(yǎng)(不給予MS)的兩組幼鼠無論是否給予Gln體重增加均滿意，無死亡，可見Gln是多種組織細(xì)胞的能量來源之一和生命物質(zhì)合成的前體，對幼鼠的正常生長發(fā)育非常必要[2,3]。國內(nèi)外對Gln的研究[4,19]均顯示，采用無Gln或低Gln喂養(yǎng)后，幼鼠出現(xiàn)不同程度的發(fā)育遲緩、落后，生存能力下降，死亡率上升。

熒光偏振度測定細(xì)胞膜流動性的變化，可用以判斷黏膜細(xì)胞的損傷程度。MS+NS組腸上皮細(xì)胞膜流動性最差，添加Gln后(MS+Gln組)好轉(zhuǎn)，考慮Gln作為谷胱苷肽前體，可通過促進(jìn)其合成來減輕腸上皮細(xì)胞膜的氧自由基損害[20]。Humbert等[21]研究顯示，Gln對保持上皮細(xì)胞膜穩(wěn)定性極其重要。

內(nèi)毒素血癥情況下，腸黏膜炎癥細(xì)胞因子水平可發(fā)生明顯改變。本研究結(jié)果顯示，MS+NS組腸黏膜炎癥細(xì)胞因子水平明顯低于MS+Glu組，提示Gln能夠調(diào)節(jié)內(nèi)源性細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[22]。在感染等炎癥刺激時，由于這些細(xì)胞因子存在紊亂，腸道容易出現(xiàn)免疫紊亂而造成抵抗病原微生物能力降低[23]。但正常喂養(yǎng)+Gln組和正常喂養(yǎng)+MS組中腸黏膜炎癥細(xì)胞因子水平相當(dāng)，提示幼鼠在Gln生理需求量足夠的情況下，額外補(bǔ)充Gln并不能增強(qiáng)腸道抵御感染的能力。

MS+NS組光鏡及電鏡下觀察腸黏膜形態(tài)可見腸黏膜發(fā)生明顯改變，腸道絨毛變短，排列有雜亂，微絨毛超微結(jié)構(gòu)有改變；MS+Gln組較MS+NS組損傷程度輕，絨毛及微絨毛出現(xiàn)一定程度的修復(fù)。提示補(bǔ)充Gln可增強(qiáng)腸黏膜修復(fù)能力,減少上皮細(xì)胞的凋亡損傷[24],阻止腸黏膜萎縮,從而能一定程度上保持腸黏膜形態(tài)和腸功能的完整。Potsic等[4]在光鏡和電鏡下觀察飲食中Gln對人工飼養(yǎng)幼鼠的胃腸道黏膜形態(tài)的影響，結(jié)果顯示去Gln飲食可導(dǎo)致胃腸道功能紊亂，而Gln合成抑制物MS可加重紊亂情況，提示Gln對保持胃腸道上皮細(xì)胞完整性至關(guān)重要。李軍等[15]研究顯示，給予LPS幼鼠腸上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹,呈空泡樣改變,微絨毛排列不整,部分緊密連接增寬,細(xì)胞核濃縮，添加Gln后顯示腸上皮細(xì)胞線粒體及絨毛損傷有明顯改善。

綜上，Gln缺乏可造成新生幼鼠腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能改變，補(bǔ)充Gln可保護(hù)內(nèi)毒素血癥新生幼鼠的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能。

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