RQ-PCR檢測(cè)Ig/TCR基因重排監(jiān)測(cè)急性淋巴細(xì)胞白血病患兒治療過程微小殘留白血病

李彥媚 葉鐵真 賴冬波 何映誼 林慧玲

目前，隨著治療方法的進(jìn)步，90%以上的兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)在誘導(dǎo)化療后可獲得完全緩解(CR)，并有70%～80%可獲得5年持續(xù)完全緩解(CCR)。然而，仍有20%～30%患兒在緩解后復(fù)發(fā)，這與體內(nèi)仍然存在形態(tài)學(xué)上無法檢測(cè)的殘留白血病細(xì)胞，即微小殘留白血病(MRD)有關(guān)。大量研究證明，MRD是最能反映個(gè)體治療效果和預(yù)后情況的指標(biāo)之一，也是引起白血病復(fù)發(fā)的最主要原因之一。在白血病治療過程中準(zhǔn)確檢測(cè)MRD并分析其意義，對(duì)臨床追蹤病情和判斷預(yù)后，并據(jù)此制定更具針對(duì)性的個(gè)體化治療方案等，具有重要意義[1]。

RQ-PCR檢測(cè)免疫球蛋白(Ig)/T細(xì)胞抗原受體(TCR)基因重排是目前定量追蹤ALL-MRD的可靠方法[2,3]。本研究以RQ-PCR檢測(cè)[4,5]Ig/TCR基因重排，監(jiān)測(cè)廣州市婦女兒童醫(yī)療中心(我院)收治ALL患兒在治療過程中MRD的變化趨勢(shì)，以評(píng)價(jià)該方法在兒童ALL中的應(yīng)用價(jià)值。

1 方法

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①2009年3月至2011年3月在我院血液腫瘤科初診和治療的ALL患兒；②均經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)[6]和免疫分型診斷[7]；③以廣東地區(qū)兒童ALL 2008化療協(xié)作組方案(GD2008ALL)進(jìn)行危險(xiǎn)度分型及化療[8]；④采集的骨髓樣本除用于細(xì)胞學(xué)檢測(cè)外的剩余標(biāo)本被用于Ig/TCR基因重排檢測(cè)。

1.2 倫理審核 本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核通過。

1.3 隨訪觀測(cè)時(shí)點(diǎn) 以下時(shí)間點(diǎn)采集骨髓標(biāo)本用于臨床評(píng)估：①初診時(shí)(0個(gè)月)；②誘導(dǎo)緩解治療末d33(隨訪1個(gè)月)；③鞏固治療前(隨訪2個(gè)月)；④早期強(qiáng)化治療前(隨訪4個(gè)月)；⑤維持治療前(隨訪6 個(gè)月)；⑥維持治療階段(由維持治療開始后每90天隨訪1次)。連續(xù)隨訪至早期強(qiáng)化治療前的患兒進(jìn)入分析。以上時(shí)間同時(shí)檢測(cè)Ig/TCR基因重排表達(dá)量。

1.4Ig/TCR基因重排檢測(cè)

1.4.1 標(biāo)本處理 骨髓標(biāo)本以Ficoll密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，并使用分離柱試劑盒(購(gòu)自中國(guó)TRANSGEN公司)提取單個(gè)核細(xì)胞DNA。

1.4.2 PCR檢測(cè)初診患兒Ig/TCR基因重排 ①選取歐洲Biomed-1和Biomed-2研究中的12對(duì)引物(表1)，以PCR擴(kuò)增每例初診ALL患兒骨髓標(biāo)本的IgH、Igκ、TCRγ和TCRδ基因重排[9,10]。PCR反應(yīng)體系包括PCR MixBuffer (10×)5.0 μL(日本TOYOBO公司)、上下游引物(由廣州英駿生物公司合成)各70 pmol、模板DNA 100 ng，加去離子水至終體積50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 7 min；94℃30 s，60℃ 45 s，72℃ 90 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。每次反應(yīng)均設(shè)陽性對(duì)照(Jurkat細(xì)胞或Reh細(xì)胞DNA)、陰性對(duì)照(正常人DNA)和空白對(duì)照(以雙蒸水取代模板DNA)；②1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

表1 PCR檢測(cè)Ig/TCR基因重排的引物序列

Tab 1 Sequence of primers forIg/TCRgene rearrange-ments detection

PrimerSequenceIgHVH1/VH7-F5'-CCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGG-3'VH3-F5'-GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA-3'VH4-F5'-TCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGC-3'JH-R5'-ACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3'IgkVk1-F5'-GTAGGAGACAGAGTCACCATCACT-3'Vk2-F5'-TGGAGAGCCGGCCTCCATCTC-3'Vk3-F5'-GGGAAAGAGCCACCCTCTCCTG-3'Vk4-F5'-GGCGAGAGGGCCACCATCAAC-3'Kde-R5'-CCTCAGAGGTCAGAGCAGGTTGTCCTA-3'TCRδVδ2-F5'-GGACATCGAGTCATGTCAGCC-3'Dδ2-F5'-AGAAGAGGGTTTTTATACTGATGTG-3'Dδ3-R5'-AGGGAAATGGCACTTTTGCC-3'TCRγVγ1-F5'-CAGGCCGACTGGGTCATCTGC-3'Vγ2-F5'-CAGCCCGCCTGGAATGTGTGG-3'Vγ4-F5'-CTGAAATATCTATTTCCAGACCAGC-3'Jγ1.3/2.3-R5'-AATGTTGTATCTTCCGATACTTACC-3'albuminabm-F5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3'abm-R5'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTT-3'

Notes F：forward primer；R：reverse primer，reverse primer labeled with FAM at 5′ site

1.4.3 基因掃描分析Ig/TCR基因重排產(chǎn)物克隆特性[10]①取上述PCR的陽性產(chǎn)物1 μL，加入9.5 μL甲酰胺和0.5 μL Genescan-500熒光標(biāo)記分子量標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)ABI公司)，置于PCR儀上反應(yīng)，95℃ 2 min，4℃ 60 min，以形成異源雙鏈DNA；②將異源雙鏈DNA置基因掃描儀(美國(guó)ABI公司)上檢測(cè)，使用儀器配置的軟件分析Ig/TCR基因重排的克隆性。

1.4.4 RQ-PCR檢測(cè)Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量 ①對(duì)經(jīng)上述基因掃描鑒定為單克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；②將測(cè)序結(jié)果輸入IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)(http://imgt.cines.fr/imgt-vquest/ share/ textes/)進(jìn)行同源性比對(duì)，確定每例患兒特異的Ig/TCR基因重排序列，以此序列為MRD追蹤靶目標(biāo)，在Primer 3.0軟件中設(shè)計(jì)特異性引物，根據(jù)IgH、Igκ、TCRγ、TCRδ基因的J片段保守序列設(shè)計(jì)探針[11]；③用正常人DNA將初診患兒骨髓DNA(600 ng)梯度稀釋至1.0×10-1～1.0×10-6濃度以建立Ig/TCR基因重排的標(biāo)準(zhǔn)曲線；以去離子水將正常人DNA梯度稀釋至1 000、500、100、50和10 ng以建立內(nèi)參基因albumin的標(biāo)準(zhǔn)曲線。RQ-PCR反應(yīng)體系見表2，反應(yīng)條件：95℃ 60 s；95℃ 15 s，60°C 60 s，共40個(gè)循環(huán)，退火溫度可根據(jù)特異性引物Tm值調(diào)整。③對(duì)各觀察時(shí)間標(biāo)本以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Ig/TCR基因重排表達(dá)量。每份樣本設(shè)2個(gè)復(fù)管，同時(shí)以albumin基因?yàn)殛栃詫?duì)照、正常人DNA為陰性對(duì)照和雙蒸水為空白對(duì)照。以Ig/TCR基因重排的表達(dá)量與albumin管基因表達(dá)量之比，即Ig/TCR基因重排的相對(duì)表達(dá)量反映MRD水平。

表2 RQ-PCR反應(yīng)體系(μL)

Notes NC: negative control; PC: positive control; F：forward primer；R：reverse primer

1.5 研究指標(biāo)的定義 ①臨床危險(xiǎn)度：誘導(dǎo)治療前按GD2008ALL方案[8]分為高危(HR)、標(biāo)危(SR)和中危(IR)。②Ig/TCR基因重排表達(dá)量危險(xiǎn)度分期：在誘導(dǎo)緩解治療結(jié)束時(shí)(d33)劃分危險(xiǎn)度：Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量<1.0×10-4為SR，～1.0×10-3為IR,≥1.0×10-3為HR；③MRD陰性：Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量<1.0×10-4；④ CCR：經(jīng)治療獲得完全緩解后，持續(xù)3～5年或更長(zhǎng)時(shí)間無復(fù)發(fā)者。⑤復(fù)發(fā)：治療達(dá)到緩解后發(fā)生以下任一項(xiàng)：a.骨髓原始細(xì)胞+幼稚細(xì)胞>0.05但<0.20，經(jīng)過有效抗白血病治療1個(gè)療程仍未達(dá)到骨髓CR標(biāo)準(zhǔn)者；b.骨髓原始細(xì)胞+幼稚細(xì)胞≥0.20者；c.骨髓外白血病浸潤(rùn)者。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 86例初診ALL患兒進(jìn)入分析，其中男52例，女34例；年齡1～13(4.3±3.0)歲；1～5歲63例，≥6歲23例；L1型50例，L2型30例，L3型6例；B-ALL 76例，T-ALL 10例； 臨床危險(xiǎn)度SR 28例，IR 40例和HR 18例。隨訪至2011年4月30日，隨訪時(shí)間1～26(14.3±7.0)個(gè)月，復(fù)發(fā)5例(5.8%)。

2.2 初診ALL患兒Ig/TCR基因重排的總檢出率 86例初診ALL患兒中，83例(96.5%)檢出1種或以上Ig/TCR基因重排，共檢出209個(gè)Ig/TCR基因重排，平均每例檢出2.52個(gè)。1種基因重排者占13.2%(11/83例)；同時(shí)存在2、3和4種Ig/TCR基因重排分別為34.9%(29例)、38.6%(32例)和13.2%(11例)。4種Ig/TCR基因重排的比例依次為IgH80.7%(67例)、TCRδ67.5%(56例)、Igκ55.4%(46例)和TCRγ49.4%(41例)。

2.3 初診患兒Ig/TCR基因重排的克隆特性 83例檢出Ig/TCR基因重排的病例中，根據(jù)患兒來院隨訪條件最大限度的依從性，61例患兒的172個(gè)Ig/TCR基因重排行基因掃描。56/61例(91.8%)可檢出1種或以上單克隆性Ig/TCR基因重排；172個(gè)Ig/TCR基因重排中，單克隆性、寡克隆性和多克隆性Ig/TCR基因重排的檢出率分別為58.1%(100個(gè))、30.8%(53個(gè))和11.0%(19個(gè))，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。

2.4 隨訪患兒Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量 26/56例單克隆性Ig/TCR基因重排患兒完成連續(xù)3次隨訪，其中22例CCR和4例復(fù)發(fā)。如表3所示，22例CCR患兒初診時(shí)Ig/TCR基因重排的相對(duì)表達(dá)量為2.70×10-1±2.55×10-1，誘導(dǎo)緩解治療結(jié)束時(shí)d33降至9.91×10-4±2.08×10-3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；在鞏固治療開始前，Ig/TCR基因重排的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步下降至7.85×10-5±2.76×10-4，與誘導(dǎo)緩解結(jié)束時(shí)d33比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)；其后至維持治療9個(gè)月期間，各檢測(cè)時(shí)點(diǎn)Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量在1.0×10-5～1.0×10-6，與相近上個(gè)隨訪時(shí)點(diǎn)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在維持治療12個(gè)月后，均未檢出Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量。

表3 22例CCR患兒不同治療時(shí)點(diǎn)的Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量

Notes m: month; 1)vsinitial; 2)vsd33; 3)compared with the last follow-up point

表4顯示，4例復(fù)發(fā)患兒初診時(shí)Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量均>1.0×10-1；在誘導(dǎo)緩解治療結(jié)束時(shí)(d33)均明顯下降，處于同期CCR病例水平。例1Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量在早期強(qiáng)化治療前開始升高，其后繼續(xù)升高，并一直維持在同期CCR病例的均值水平以上，至維持治療6個(gè)月時(shí)骨髓復(fù)發(fā)，從回升至骨髓復(fù)發(fā)為8個(gè)月；例2的Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量在誘導(dǎo)緩解治療結(jié)束時(shí)(d33)至早期強(qiáng)化治療前呈下降趨勢(shì)，但一直高于同期CCR病例水平，至維持治療前開始回升，在維持治療3個(gè)月時(shí)出現(xiàn)骨髓復(fù)發(fā)，從回升至骨髓復(fù)發(fā)為3個(gè)月；例3和4Ig/TCR基因重排的相對(duì)表達(dá)量在鞏固治療前回升至同期CCR病例水平以上，均在早期強(qiáng)化前即出現(xiàn)骨髓復(fù)發(fā)，從回升到骨髓復(fù)發(fā)均為2個(gè)月。復(fù)發(fā)病例4經(jīng)再予誘導(dǎo)緩解治療后，Ig/TCR基因重排表達(dá)量降至8.66×10-4。4例患兒Ig/TCR基因重排的相對(duì)表達(dá)量開始回升至臨床復(fù)發(fā)的平均時(shí)間為3.75(2～8)個(gè)月。

表4 4例復(fù)發(fā)患兒不同治療時(shí)點(diǎn)的Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量

Notes m: month; red fonts indicated relapse

2.4 臨床危險(xiǎn)度與Ig/TCR基因重排劃分危險(xiǎn)度的關(guān)系 表5顯示，26例隨訪患兒誘導(dǎo)治療結(jié)束時(shí)(d33)根據(jù)Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量劃分危險(xiǎn)度，SR 10例(38.5%)，IR 12例(46.2%)，HR 4例(15.4%)；誘導(dǎo)治療前SR 7例(26.9%)，IR 13例(50.0%)，HR 6例(23.1%)。兩者分級(jí)一致11例(42.3%)，其中SR 4例、IR 5例、HR 2例。

4例復(fù)發(fā)患兒初診時(shí)IR 3例，SR 1例；根據(jù)Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量重新劃分危險(xiǎn)度，例3原為SR調(diào)整為IR(Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量為8.00×10-4)，例2原為IR調(diào)整為HR(Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量為1.20×10-3)，例1和4的分級(jí)不變。

表5 臨床危險(xiǎn)度分級(jí)與根據(jù)Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量劃分危險(xiǎn)度分級(jí)結(jié)果(n)

Tab 5 Comparison of risk stratification by clinical data andIg/TCR(n)

Ig/TCRriskClinicalriskSRIRHRSR460IR354HR022

Notes SR: standard risk; IR: intermediate risk; HR: high risk

3 討論

3.1 聯(lián)合檢測(cè)多種Ig/TCR基因重排可保證檢出率 文獻(xiàn)報(bào)道，Ig/TCR基因重排在兒童和成人ALL中均具有極高的檢出率，97%以上B-ALL患者可檢出1種Ig/TCR基因重排[12]。歐洲白血病治療協(xié)作組通過Biomed-1和Biomed-2研究，已建立了PCR檢測(cè)Ig/TCR基因重排的通用引物系統(tǒng)，該系統(tǒng)所使用的引物共108對(duì)，Ig/TCR基因重排的檢出率達(dá)到100%。但該系統(tǒng)引物數(shù)量較多，不利于其臨床應(yīng)用。Szczepański等[13]選用Biomed-1引物系統(tǒng)中的25對(duì)引物檢測(cè)96例初診B-ALL患兒的IgH、Igκ、TCRδ和TCRγ基因重排，結(jié)果顯示98%患兒可檢出Ig/TCR基因重排。本研究初診ALL患兒Ig/TCR基因重排的檢出率達(dá)96.5%，提示通過聯(lián)合檢測(cè)多種Ig/TCR基因重排，既可減少引物的數(shù)量，同時(shí)又可獲得較高的檢出率，這可能更適合兒科臨床實(shí)際，提高臨床應(yīng)用的可行性。

3.2 基因掃描可有效篩選出不同克隆特性的Ig/TCR基因重排 寡克隆性基因重排在兒童B-ALL中常見，其中寡克隆性IgH和TCRδ基因重排發(fā)生率為30%～40%[13]；并且不同克隆來源的基因重排在白血病治療過程中可發(fā)生優(yōu)勢(shì)變化，若以寡克隆性基因重排作為MRD檢測(cè)的靶目標(biāo)，則可因?yàn)殡S訪過程中靶目標(biāo)的丟失，使MRD檢測(cè)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，多個(gè)研究機(jī)構(gòu)均建議初診時(shí)應(yīng)對(duì)Ig/TCR基因重排進(jìn)行克隆性分析[5,11,13]，首選單克隆性基因重排作為MRD檢測(cè)的靶目標(biāo)。本研究采用基因掃描方法，對(duì)ALL患兒的Ig/TCR基因重排PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆性分析，結(jié)果符合白血病淋巴細(xì)胞Ig/TCR基因重排的克隆特點(diǎn)，提示基因掃描可準(zhǔn)確分析Ig/TCR基因重排的克隆性，有效篩選出不同克隆特性的Ig/TCR基因重排。

3.3Ig/TCR基因重排可評(píng)價(jià)療效和判斷預(yù)后 本研究22例CCR患兒的Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量在誘導(dǎo)治療后明顯下降，并隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)下降，直至陰性。Li等[14]用RQ-PCR擴(kuò)增Ig/TCR基因重排，對(duì)36例誘導(dǎo)緩解化療d29的B-ALL患兒進(jìn)行MRD定量檢測(cè)，MRD水平≥1.0×10-3與復(fù)發(fā)顯著相關(guān)(P=0.002 5)。Zhou等[15]以RQ-PCR檢測(cè)284例B-ALL患兒Ig/TCR基因重排，誘導(dǎo)治療結(jié)束時(shí)Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量<1.0×10-3者5年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)為12%，≥1.0×10-3者為72%。Ryan等[16]分別在誘導(dǎo)治療15 d、鞏固治療、強(qiáng)化治療結(jié)束等時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)以上各時(shí)點(diǎn)的MRD水平均與復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，尤其≥1.0×10-3者在短期內(nèi)有復(fù)發(fā)傾向。本研究中4例復(fù)發(fā)的ALL患兒，復(fù)發(fā)前Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量均已回升，從開始回升至復(fù)發(fā)的平均時(shí)間為3.75(2～8)個(gè)月，并在復(fù)發(fā)時(shí)Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量均升至1.0×10-2以上；提示Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量下降后又重新回升，有預(yù)示復(fù)發(fā)的意義，對(duì)此部分患兒應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)或調(diào)整治療。

本研究在誘導(dǎo)治療后根據(jù)Ig/TCR基因重排表達(dá)量劃分危險(xiǎn)度，15/26例與初診時(shí)的危險(xiǎn)度分級(jí)不一致，其中4例復(fù)發(fā)患兒誘導(dǎo)化療結(jié)束時(shí)，以Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量重新劃分危險(xiǎn)度，1例原為IR調(diào)整為HR，1例SR患兒調(diào)整為IR，即2例患兒的危險(xiǎn)度升級(jí)。提示在誘導(dǎo)緩解治療結(jié)束時(shí)，按Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量重新劃分危險(xiǎn)度可準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)療效、判斷預(yù)后。

3.4 本研究的不足之處和局限性 ①由于患兒入組時(shí)間不一致，部分患兒未完成本研究設(shè)定的連續(xù)3次隨訪；同時(shí)部分患兒失訪，導(dǎo)致本研究進(jìn)入Ig/TCR基因重排相對(duì)表達(dá)量動(dòng)態(tài)分析的樣本量不多；②納入復(fù)發(fā)患兒僅4例，因此無法按B-ALL 和T-ALL進(jìn)一步分析。

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