高效液相色譜法測定兩種巖陀中巖白菜素的含量

彭朝霞，楊朝蓮，熊然英，晏祥杰

(六盤水市藥品檢驗所，貴州 六盤水 553001)

巖陀是虎耳草科鬼燈檠屬植物西南鬼燈檠(Rodgersia sambucifolia Hemsl)的根莖，性味:苦、澀，涼;功能主治:清熱涼血，調(diào)經(jīng)止痛。用于腸炎，痢疾，痛經(jīng)，月經(jīng)過多，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，跌打損傷;外用治外傷出血，陰囊濕疹［1］。其根莖富含虎耳草素(Bergenin)又稱巖白菜素，主要作用是鎮(zhèn)咳祛痰，用于慢性支氣管炎［2］。近來的藥理實驗發(fā)現(xiàn)巖白菜素除具有鎮(zhèn)痛抗炎作用外［3］，還具有抗炎、護(hù)肝、抗?jié)?、提高免疫等作?。巖白菜素已制成各種單方或復(fù)方制劑用于臨床?，F(xiàn)在的巖陀均為野生藥材，生長在1 600～2 200米的海拔高度。主要分布在四川西南部、貴州(威寧、六盤水)和云南北部，貴州省六盤水市等地還將羽葉鬼燈擎(Rodgersia pinnata Franch)的根莖作為巖陀入藥。為更好地對巖陀質(zhì)量進(jìn)行控制，我們采用高效液相色譜法對巖陀中巖白菜素的含量進(jìn)行了分析。

1 儀器與試藥

Waters1525高效液相色譜儀;Waters2487紫外檢測器;Brezz色譜工作站(版本:3.3);島津UV-2550型紫外-可見分光光度計。

樣品1:羽葉鬼燈擎(水城縣勺米鄉(xiāng)魚塘村);樣品2:西南鬼燈擎(水城縣勺米鄉(xiāng)嚴(yán)家埡口);樣品3:西南鬼燈擎(水城縣勺米鄉(xiāng)范家寨村);樣品4:西南鬼燈擎(水城縣勺米鄉(xiāng)三棵樁);樣品5:西南鬼燈擎(水城縣哈青村);樣品6:西南鬼燈擎(水城縣韭菜坪)。所有樣品均經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院中藥系陳德媛教授鑒定。

巖白菜素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:111532-200202)。

乙腈為色譜純;水為純凈水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流速:1.0 mL/min;柱溫:25℃;流動相:乙腈-水(10∶90);檢測波長:274 nm。理論板數(shù)按巖白菜素峰計應(yīng)不低于5 000。結(jié)果表明，在該色譜條件中，巖白菜素峰和其他成分峰均能完全分離，分離度大于1.50，符合要求。典型色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取巖白菜素對照品(五氧化二磷減壓干燥20 h)49.21 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得巖白菜素對照品儲備液(每1 mL含巖白菜素0.492 1 mg)。精密量取儲備液4 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得巖白菜素對照品溶液(每1 mL含巖白菜素196.84 μg)。

2.3 供試品溶液的制備

取巖陀粉末(過40目篩)0.15 g，精密稱定，加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲提取40 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取巖白菜素對照品儲備液0.1，0.5，1，2，3，4，5，6，7 和 8 mL 分別置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。分別精密量取10 μL注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進(jìn)行試驗。以進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程:Y=1 340 000 X+21 471，r=0.999 8。結(jié)果表明，巖白菜素在進(jìn)樣量0.049 21～3.396 8 μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

取巖白菜素對照品溶液10 μL注入色譜儀進(jìn)行試驗，重復(fù)6次，峰面積RSD為0.5%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取巖陀粉末(樣品2)約0.15 g，精密稱定，按2.3項下方法制備供試品溶液。分別于0，2.5，5，7，9.5，12，14.5，17，19.5，22，24，26，28 h 精密吸取 10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。0～24 h峰面積RSD為1.9%，表明巖白菜素室溫下24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 重復(fù)性試驗

分別稱取巖陀(樣品2)粉末6份，每份0.15 g，精密稱定后按2.3項下制備供試品溶液，取10 μL進(jìn)樣測定，以干燥品計算平均含量和RSD。巖白菜素的平均含量為10.06%，RSD為1.86%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗

精密吸取0.492 1 mg/mL巖白菜素對照品溶液2，5，10 mL各3份，分置9個具塞錐形瓶中，水浴揮干。分別加入精密稱定的樣品2粉末(水分9.47%)約0.1 g，按2.3項下制備供試品溶液，吸取10 μL進(jìn)樣測定，計算回收率，結(jié)果見表1。巖白菜素的平均回收率為99.06%，RSD為1.56%。

表1 回收率試驗結(jié)果

2.9 樣品含量測定

取巖陀粉末約0.15 g，精密稱定，按2.3項下的方法制備樣品溶液，同時分別測定每個樣品的水分，以干燥品計算樣品中巖白菜素的含量。樣品1～6的巖白菜素含量依次為7.63%，10.05%，8.66%，9.38%，6.16%和8.40%。

3 討論

3.1 波長的選擇

相關(guān)文獻(xiàn)記述巖白菜素檢測波長有220，275和260 nm等［5-8］，為選擇合適的檢測波長，對巖白菜素對照品溶液(22.4 μg/mL)進(jìn)行了紫外光譜掃描。結(jié)果表明，巖白菜素在306.2與274.0 nm波長處有最大吸收，且274.0 nm波長處吸光度較大，故選用274 nm為檢測波長。

3.2 流動相選擇

文獻(xiàn)記述檢測巖白菜素的流動相有甲醇-水［5］、甲醇-0.2%磷酸［6］、1%醋酸溶液(用三乙胺調(diào) pH 3.7)-甲醇-乙腈［8］等，比較巖白菜素在甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸各流動相條件下的檢出效果，流動相為乙腈-水(10∶90)時，巖白菜素分離效果好，檢出雜質(zhì)峰較少，且與相鄰雜質(zhì)峰分離度較好，響應(yīng)值較高，更利于巖白菜素含量的檢測，故選用乙腈-水(10∶90)作為流動相。

3.3 提取方法選擇

巖白菜素在甲醇中溶解，在水和乙醇中微溶［2］，故采用甲醇作為提取溶劑。

比較了30 min回流提取、20，40，60和90 min超聲提取的效果。超聲40 min提取樣品，巖白菜素含量較高;超聲20 min提取液中巖白菜素的含量較低;其余三種方法提取效果無顯著差異，為使方法簡便易行，又能盡量將巖白菜素提取出來，故使用超聲40 min提取樣品。

4 結(jié)論

目前巖陀的植物資源短缺，市場需求量較大，我市巖陀的巖白菜素含量在6%以上，云南產(chǎn)(為巖陀高產(chǎn)區(qū))巖陀的巖白菜素含量大約在3%(此數(shù)據(jù)為貴州省重點實驗室提供)，在我地民間有將羽葉鬼燈擎作為巖陀使用的情況，其療效與西南鬼燈擎差不多［9］，且其根莖中所含巖白菜素與正品巖陀所含巖白菜素相差不大，故可將羽葉鬼燈擎做為巖陀的一個藥用資源使用，以擴(kuò)大藥源，解決野生巖陀資源短缺的問題。

本文建立了巖陀中的巖白菜素高效液相色譜測定方法，并對不同產(chǎn)地巖陀及替代品中的巖白菜素含量進(jìn)行了測定，建議在巖陀質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加巖白菜素含量測定。

［1］ 《中藥辭?！肪帉懡M.中藥辭海［M］.第二卷.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1996:817-818.

［2］ 中國藥典［S］.一部.2005:278.

［3］ 黃麗萍，吳素芬.巖白菜素鎮(zhèn)痛抗炎作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2009，25(3):24.

［4］ 夏從龍，劉光明，馬曉匡.巖白菜素的研究進(jìn)展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17(3)B:432-433.

［5］ 楊懷鏡，姚宏春，張全望.HPLC法測定巖白菜素和復(fù)方巖白菜素片的含量［J］.中國藥事，2003，17(3):171.

［6］ 王曉瓊，康紅英，陳聲晶.RP-HPLC法測定地茶止咳露中巖白菜素的含量［J］.中國藥事，2010，24(12):1224.

［7］ 馬曉云，宋愿智，湯利榮，等.卡虎素含量測定的實驗研究Ⅰ.巖白菜素含量測定的實驗研究［J］.中國生化藥物雜志，1993(4):56-57.

［8］ 張玉華.復(fù)方巖白菜素片中巖白菜素和馬來酸氯苯那敏的含量測定［J］.中國藥業(yè)，2008，17(21):25.

［9］ 貴州中藥資源普查辦公室、貴州中藥研究所.貴州中藥資源［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1992:693.