類泛素蛋白FAT10共價結合底物蛋白質的活性分析

于 欣 王英明 吳燕華 金成學 穆 穎 喬守怡△

（1復旦大學生命科學學院遺傳工程國家重點實驗室 上海 200433；2金日成大學平壤醫(yī)學院基礎醫(yī)學部 平壤）

泛素最先由Goldstein等［1］在1975年從胸腺中分離出來，是一條由76個氨基酸殘基組成的高度保守的多肽鏈，在真核細胞內廣譜表達［1］。泛素由5個β片層圍繞1個α螺旋組成，這個特征結構又被稱為泛素折疊（ubiquitin fold）［2］。在泛素激活酶E1、E2及E3的作用下，泛素選擇性地修飾蛋白質底物，被泛素標記的蛋白質分子隨后經(jīng)過26S蛋白酶體途徑進行降解［3］。其中，在泛素48位賴氨酸殘基上形成含有至少4個泛素單體聚合而成的多泛素鏈，可以介導蛋白質底物進入26S蛋白酶體降解［4］，在泛素63位賴氨酸殘基形成的多泛素鏈與DNA修復及信號傳導等細胞內生命活動有關［5］，而泛素以單體形式共價結合底物蛋白質則與細胞內吞及轉錄調控有關［6］。受泛素調控的底物蛋白質包括細胞周期蛋白、核轉錄因子、信號轉導因子等。泛素－蛋白酶體系統(tǒng)與蛋白質質量控制、細胞周期調控、DNA修復、基因表達及免疫應激等事件密切相關，還參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展［7］。

類泛 素 蛋 白 質 家 族 （ubiquitin like protein，UBL）是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一類小分子蛋白質，含有與泛素高度同源的結構域，在細胞生長調控中發(fā)揮多種重要作用［8］。UBLs又可分為兩個亞家族：類泛素結構域蛋白家族（ubiquitin domain protein，UDP）和類泛素修飾蛋白家族（ubiquitin like modifier，ULM）［9］。UDP可以與泛素以及泛素修飾蛋白質發(fā)生非共價結合，代表成員有Elongin B［10］、RAD23［11］、Dsk2［12］、Bag1［13］等。研 究 發(fā) 現(xiàn)，Elongin B參與調控基因表達過程中mRNA鏈的延伸［10］，而RAD23與DNA受紫外線損傷后的修復有關［11］。ULM具有與泛素單體或二聚體同源的結構域，可以在E1、E2、E3的催化下通過C末端的雙甘氨酸基團與底物蛋白質共價結合，代表成員有ISG15、FUB1、NEDD8、SUMO、Urm1、UBL5、Ufm1等。其中，ISG15可以被干擾素誘導表達，參與調控細胞生長和分化［13］；FUB1調控淋巴細胞活化 和 增 殖［14］；NEDD8 參 與 細 胞 周 期 調 控［15］；SUMO參與細胞周期調控、核運輸、DNA轉錄與修復［16］；Urm1 與 氧 化 應 激 反 應 有 關［17］；UBL5 參 與mRNA 前 體 剪 接［18］；Ufm1 參 與 內 質 網(wǎng) 應 激反應［19］。

FAT10基因位于人類6號染色體上I型主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC）編碼區(qū)域的末端［20］。FAT10是新近發(fā)現(xiàn)的ULM成員，N末端和C末端各含有1個與泛素高度同源的結構域，又被稱為雙泛素。人FAT10主要表達在胎盤、胸腺、脾、淋巴結、胚胎及成熟的 B 細胞和樹 突 細 胞 （dendritic cell，DC）內［21］。已有的研究工作提示FAT10具有共價結合底物蛋白質、調節(jié)蛋白質降解的生物學活性，在細胞周期、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用［22－24］。FAT10在肝癌和胃腸癌組織中高表達［25－26］。聯(lián)用干擾素和腫瘤壞死因子可以誘導FAT10的表達［27］。此外，研究還表明FAT10與p53密切相關，一方面p53可以直接結合FAT10的啟動子，下調FAT10的表達［28］；另一方面，F(xiàn)AT10又可以共價修飾p53并提高p53的轉錄活性［29］。Nagashima等［30］發(fā)現(xiàn)FAT10可以共價修飾多聚谷氨酸蛋白質并調控其溶解性。但是，F(xiàn)AT10調節(jié)蛋白質降解的作用機制尚不清楚。本文通過對比FAT10突變體與野生型FAT10在HEK293T細胞中共價結合蛋白質底物的活性，發(fā)現(xiàn)FAT10的雙泛素結構域及C末端的雙甘氨酸基團都是FAT10與蛋白質底物結合所必需的。

材料和方法

抗體抗人FAT10多克隆抗體、抗人β－actin單克隆抗體、抗HA tag單克隆抗體、鼠IgG（美國Sigma公司），HRP耦聯(lián)二抗（美國Upstate公司）。

細胞培養(yǎng)HEK293T細胞（ATCC）。DMEM高糖培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、丙酮酸鈉（終濃度1mmol／L），于37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)。

FAT10基因的克隆依照NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中FAT10（Accession number NM＿006398）的cDNA序列設計引物：正向引物5′－GGGGATTTCCAACTCAACT－3′，反 向 引 物 5′－GGTCACCCTCCAATACAAT－3′。以人的胸腺cDNA文庫為模板，PCR擴增反應條件：94℃變性5min，94℃、30 s，58℃、30s，72℃、45s，30個循環(huán)反應，72℃延伸7 min。產(chǎn)物回收后連接至pMD18－T載體，轉化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細菌后挑取陽性克隆測序鑒定。

FAT10野生型及突變體真核表達載體的構建

以測序正確的pMD18－T－FAT10為模板，以正向引物5′－CCCGAATTCCCATGGCTCCCAATGCTTCCTGCCTCT－3′和反向引物5′－CCCGGTACCCTACTACCCTCCAATACAATAAGATGCCAGG－3′擴增，將FAT－10全長基因構建到哺乳動物表達載體pCMV－HA中。以 正 向 引 物 5′－CCCGAATTCCCATGGCCCCAATGCTTCCTGCCTCT－3′和 反 向 引 物 5′－CCCGGTACCCTACTACAAGGGCAGCTCCTCATCACTGGGC－3′擴增FAT10的N端泛素結構域，構建pCMVHA－FAT10－N。以 正 向 引 物 5′－CCCGAATTCGGTTTCTTGTGGAGTCAGGTGATGAGG－3′和 反 向引 物 5′－CGTAAGCTTCTTTCCCAGACGCTGTTCACAG－3′擴增FAT10的C端泛素結構域，構建pCMV－HA－FAT10－C。按照Strategene方法進行點突變實驗，構建FAT10末端雙甘氨酸基團GG突變?yōu)锳V 的pCMV－HA－FAT10ΔGG。

哺乳動物細胞的質粒轉染將HEK293T以3．0×105／孔的密度接種于12孔培養(yǎng)板中，24h后按照Lipofectin 2000TM（Invitrogen）操作說明，分別將1．6μg野生型及突變體FAT10重組質粒與脂質體混合后加入到HEK293T細胞中，6h后更換完全培養(yǎng)基終止轉染，繼續(xù)培養(yǎng)48h后裂解細胞。MG132處理組：轉染后6h更換含有 MG132（20 μmol／L）的完全培養(yǎng)基，對照組加入相同體積的DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)48h后裂解細胞。

蛋白質裂解與Western blot檢測PBS清洗細胞后，加入RIPA緩沖液4℃裂解細胞60min。4℃下12 000r／min離心10min，取上清，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水浴3min，獲得全細胞蛋白抽提液。經(jīng)12%SDS－PAGE電泳分離后轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉60min后，4℃下一抗孵育過夜，TBST洗滌4遍后加入HRP耦聯(lián)二抗，室溫孵育45min，TBST洗滌4遍后加入ECL底物，獲取熒光照片。

結 果

FAT10基因克隆及其突變體的構建我們利用人胸腺組織的cDNA文庫為模板，成功擴增了FAT10基因的開放閱讀框（圖1，泳道1），并將其構建到哺乳動物表達載體pCMV－HA中獲得pCMV－HAFAT10重組質粒。以全長FAT10為模板，分別擴增其 N端（1－90aa）和C端（91－165aa）的泛素結構域（圖1，泳道2、3）并構建到pCMV－HA中獲得pCMV－HAFAT10－N，pCMV－HA－FAT10－C。酶切和測序結果表明插入片段的大小、方向和序列均正確。以全長FAT10為模板，利用定點突變法將C末端GG突變?yōu)锳V，獲得pCMV－HA－FAT10ΔGG，測序結果正確。野生型FAT10及其突變體的蛋白質結構域示意圖如圖2所示。

圖1 FAT10、FAT10－N和FAT10－C的PCR擴增結果Fig 1 PCR amplification of FAT10，F(xiàn)AT10－N and FAT10－C

野生型FAT10具有共價結合底物蛋白質的活性接種HEK293T細胞，轉染不同劑量的pCMVHA－FAT10，48h后收獲全細胞裂解液，用HA抗體檢測細胞內FAT10基因表達情況。隨著pCMVHA－FAT10質粒濃度的遞增，HA－FAT10（相對分子質量21 000）的表達水平也梯度增加（圖3）。同時，在HA－FAT10條帶的上方還出現(xiàn)了梯度增強的雜交信號，而轉染空載體的對照組中未出現(xiàn)非特異性抗體結合信號。結果說明，外源表達的HAFAT10可以共價結合內源的一些蛋白質底物，形成相對分子質量較大的復合物。

圖2 FAT10、FAT10ΔGG、FAT10－N和FAT10－C的結構示意圖Fig 2 Schematic representation of the architecture of FAT10，F(xiàn)AT10ΔGG，F(xiàn)AT10－N and FAT10－C

圖3 野生型FAT10共價結合底物蛋白質Fig 3 Wild－type FAT10can covalently conjugate to unidentified protein substrates

FAT10通過C末端雙甘氨酸基團及雙泛素結構域共價結合底物蛋白質為了分析FAT10共價結合底物蛋白質的活性結構域，分別在HEK293T細胞中過表達FAT10的C末端雙甘氨酸基團缺失突變體及N端、C端泛素結構域截斷突變體，比較其與野生型FAT10共價結合底物蛋白質的活性水平。質粒轉染和Western blot分析方法同前。圖4顯示 了 瞬 時 轉 染 pCMV－HA－FAT10 與 pCMVHA－FAT10ΔGG 突 變 體 后 HEK293T 細 胞 中FAT10蛋白表達及其共價結合蛋白質的情況：與野生型FAT10相比，F(xiàn)AT10ΔGG的蛋白質表達水平基本相同，但共價結合底物蛋白質的信號僅在長時間曝光后才能少量顯現(xiàn)，說明C末端的雙甘氨酸對于FAT10結合底物蛋白質是必需的。此外，對比分析野生型FAT10和FAT10ΔGG共價結合的蛋白質的帶型分布，發(fā)現(xiàn)末端雙甘氨酸突變后，F(xiàn)AT10結合的主要蛋白質底物的類型也出現(xiàn)了變化：FAT10－底物蛋白質復合物在相對分子質量（Mr）35 000的主帶在FAT10ΔGG中消失，新的主帶出現(xiàn)在Mr50 000～60 000區(qū)域。

圖4 FAT10通過C末端的雙甘氨酸共價結合底物蛋白質Fig 4 The C－terminal diglycine motif of FAT10is required for its interaction with unidentified protein substrates

接下來，進一步對比分析含有單個泛素結構域的FAT10截斷突變體結合底物蛋白質的活性。HA－FAT10－N與 HA－FAT10－C的條帶均位于Mr10 000的條帶附近，符合分子量大小特征。對比全長FAT10，截斷突變體仍具有一定的底物結合活性，但結合能力顯著降低（圖5），表明FAT10的單泛素結構域不足以實現(xiàn)野生型FAT10的全部底物結合活性。此外，截斷突變體結合底物的種類也有變化，幾乎喪失了與大分子量蛋白結合的能力。

圖5 FAT10通過雙泛素結構域共價結合底物蛋白質Fig 5 Both UBL domains of FAT10are required for itsbinding to unidentified protein substrates

FAT10參與26S蛋白酶體介導的蛋白質降解途徑為了證明FAT10及其截斷突變體結合底物蛋白質后是否參與了26S蛋白酶體介導的蛋白質降解途徑，我們利用26S蛋白酶體特異性抑制劑MG132處理細胞后再次分析了FAT10及其突變體共價結合蛋白質的活性變化。經(jīng)MG132處理后，F(xiàn)AT10、FAT10－N 與 FAT10－C自身的表達水平及其共價結合的蛋白質信號均有顯著提高，表明不僅FAT10自身及其共價結合的底物蛋白質能夠通過26S蛋白酶體途徑進行降解，F(xiàn)AT10－N和FAT10－C突變體盡管底物結合活性較弱，但同樣能夠介導底物蛋白質通過26S蛋白酶體進行降解（圖6）。

圖6 FAT10及其截斷突變體參與26S蛋白酶體依賴的蛋白質降解途徑Fig 6 FAT10and its both UBL domains promote26Sproteasome－dependent protein degradationLane 1：Vector；Lane 2：FAT10－N；Lane 3：FAT10；Lane 4：FAT10－C．

討 論

蛋白質翻譯后在氨基酸鏈上可以共價結合多種基團，如糖基、磷酸基、甲基、乙?；?，這些修飾機制極大地擴展了生命體內蛋白質功能的多樣性。而泛素分子通過共價結合底物蛋白質影響蛋白質的命運，是生物體內重要的蛋白質翻譯后修飾途徑。ULM家族與泛素有高度序列同源性，并且具有泛素折疊空間結構［31］。ULM家族的作用途徑與泛素相似，在特異性E1、E2、E3酶的作用下，通過末端的甘氨酸基團共價修飾底物蛋白質，影響底物蛋白質的定位、半衰期、與其他蛋白質的相互作用等，進而對細胞生命活動進行調控［9］。但是目前關于ULM的生物學作用與分子機制尚缺乏深入認識。

FAT10在N端和C端各具有一個類泛素結構域，C末端具有一個保守的雙甘氨酸基序，是近年來新發(fā)現(xiàn)的ULM成員。已有研究提示FAT10可以通過末端雙甘氨酸基團共價結合蛋白質底物，但具體的機制以及底物蛋白質的種類仍在探索中。本研究中，我們首先在HEK293T細胞過表達FAT10后利用Western blot證明FAT10確實能夠結合內源蛋白質底物，而末端雙甘氨酸突變后，F(xiàn)AT10結合底物蛋白質的能力顯著下降，這兩組實驗結果說明FAT10末端雙甘氨酸基團對FAT10條帶上方出現(xiàn)雜交信號是必需的。由于并無實驗報道顯示泛素識別和結合位點與目標蛋白質C末端雙甘氨酸基團有關，因此我們推測這些特異性出現(xiàn)的雜交并不是FAT10自身泛素化修飾所致，而是FAT10以類似泛素的方式（即通過自身末端的雙甘氨酸基團），與多種底物蛋白質共價結合，這一發(fā)現(xiàn)與Raasi等［22］在HeLa細胞系及Chiu等［32］在HEK293細胞系中獲得的結果一致。我們的研究還發(fā)現(xiàn)FAT10單獨的N末端泛素結構域與C末端泛素結構域具有部分結合底物蛋白質的活性，而且單獨的泛素結構域所結合的底物蛋白質條帶種類不同，表明FAT10的N末端和C末端泛素各自識別并標記不同的底物蛋白質。Chang等［33］在研究另一個雙泛素分子ISG15的泛素結構域的過程中發(fā)現(xiàn)，ISG15單獨的C末端泛素結構域可以將ISG15運送至E1分子UBE1L和E2分子UbcH8上，而其N端泛素結構域則對E3分子的識別和招募起到重要作用。因此，我們推測FAT10的N端和C端泛素結構域結合底物蛋白質的差異可能與FAT10與E1、E2、E3分子的作用機制有關。

26S蛋白酶體由1個20S亞基和2個19S亞基組成，可以將被泛素標記的底物蛋白質分解為較小的多肽、氨基酸以及可以繼續(xù)重復利用的泛素分子［7］。Kamitani 等［34］發(fā) 現(xiàn) NEDD8 互 作 蛋 白（NEDD8ultimate buster－1，NUB1）可 以 介 導NEDD8及其共價修飾蛋白質底物在26S蛋白酶體內降解。FAT10是目前發(fā)現(xiàn)的第2個具有標記并介導蛋白質通過蛋白酶體降解功能的類泛素分子［24］：Schmidtke 等［35］研 究 發(fā) 現(xiàn)，F(xiàn)AT10 與NUB1L的非共價結合可促進FAT10與蛋白酶體相互作用，進而介導底物蛋白質降解。我們研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)蛋白酶體抑制劑處理后，F(xiàn)AT10及其共價結合底物蛋白質的信號均顯著增強，與已知的研究結果一致。我們還發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑還能增強FAT10兩個截斷突變體本身及其共價結合底物蛋白質的信號，表明FAT10的2個泛素結構域也都能通過標記底物蛋白質介導蛋白質進入26S蛋白酶體降解。

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