食管癌組織中人乳頭瘤病毒16型整合狀態(tài)的檢測(cè)

張 科 李淑英 丁廣成 趙 瑩 劉文博 張?jiān)迫?/p>

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000)

人乳頭瘤病毒(HPV)屬DNA病毒，與許多部位鱗狀上皮細(xì)胞良性及惡性腫瘤性病變有關(guān)，其中HPV感染與宮頸癌的相關(guān)性已得到公認(rèn)。研究顯示，食管癌組織中有HPV基因存在。病毒整合是惡性進(jìn)展的一個(gè)標(biāo)志，大部分腫瘤含一些整合的HPV拷貝〔1～3〕，HPV整合常引起HPV E2閱讀框架(ORF)的斷裂或缺失，使E6和E7表達(dá)升高，有利于惡性轉(zhuǎn)化。為進(jìn)一步探討HPV感染與食管癌發(fā)生的相關(guān)性，本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，檢測(cè)了食管癌患者組織標(biāo)本中HPV的整合狀態(tài)及病毒載量。

1 材料與方法

1.1 材料 河南省林州市食管癌患者手術(shù)切除組織標(biāo)本55例，男21例，女34例，平均年齡為58(46～68)歲。組織切除后立即放入－70℃冰箱保存。293細(xì)胞DNA作為內(nèi)參的陽(yáng)性對(duì)照;含有HPV16E2基因質(zhì)粒、HPV16 E6-E7質(zhì)粒及β-actin質(zhì)粒本室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 本研究中應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR的原理是依據(jù)下列假設(shè)：HPV整合時(shí)最常缺失的E2開放閱讀框(ORF)的特殊區(qū)域，如HPV以游離型形式存在，E2與 E6拷貝數(shù)比例相等;如HPV整合在宿主染色體中，E2缺失，E2與 E6拷貝數(shù)比例為零;如HPV以游離、整合的混合型形式存在，E2的拷貝數(shù)少于E6。E2與E6比率代表HPV整合狀態(tài)。因此，根據(jù)GenBank提供的基因序列設(shè)計(jì)引物，選擇HPV16三個(gè)E2基因區(qū)和一個(gè)E6基因區(qū)位點(diǎn)設(shè)計(jì)HPV16E2和E6引物及β-actin引物(如表1)。委托上海生工合成引物。

1.2.2 組織標(biāo)本中DNA的提取及質(zhì)量控制 使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，德國(guó))，按說明書指示，食管癌組織標(biāo)本經(jīng)液氮冷凍研磨后，提取組織DNA于-－0℃保存。使用β-Actin作內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)所提DNA的質(zhì)量。PCR中使用了 Ex-Taq(寶生物，大連)，每個(gè)反應(yīng)總體積為25 μl，加入0.5 μl提取的DNA為模板，以293細(xì)胞DNA(或β-Actin質(zhì)粒)為陽(yáng)性對(duì)照。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，循環(huán)參數(shù)95℃/1 min，55℃ /1 min，72℃ /1 min，5 個(gè)循環(huán);95℃ /20 s，55℃ /30 s，72℃ /30 s，40個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min;4℃保存。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR的引物序列及大小

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)組織標(biāo)本中HPV16、病毒載量及整合狀態(tài) 用上述表1的引物。EvaGreen熒光染料，在Rotor Gene熒光PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用每套引物將六個(gè)梯度的質(zhì)粒和每一例待檢樣品平行分析三次。首先，用HPV16E6型特異性引物檢測(cè)HPV16;第二，β-actin引物檢測(cè)其含量;第三，用HPV16E2引物進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系(25 μl)：1×Ampli-Taq Gold Buffer(MgCl2free)，2.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L 混合 dNTPs，2 pmol/L 引物，1.25 μl 20 × EvaGreen，0.25 μl Rx，5 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶，加入0.5 μl癌組織標(biāo)本DNA作為模板，加雙蒸水至25 μl，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)中，用雙蒸水作為陰性對(duì)照，用六個(gè)稀釋梯度的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照。病毒載量(copies/cell)由下列公式計(jì)算：(E6copy/β-actincopy)×2，其結(jié)果為每個(gè)細(xì)胞中HPV16的拷貝數(shù);整合狀態(tài)由E2與E6的拷貝數(shù)的比值決定。

2結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行HPV16、病毒載量及整合狀態(tài)分析

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到每一待檢標(biāo)本的β-actin、E2、E6基因的拷貝數(shù)。每1例標(biāo)本用每對(duì)引物平行分析三次，取三次平行分析結(jié)果的平均值，結(jié)果55例標(biāo)本中檢測(cè)到32例標(biāo)本陽(yáng)性，其陽(yáng)性率為58.2%;每例樣品所含有HPV16的病毒載量為0.066～65.2拷貝(如表2)。

表2 32例HPV16陽(yáng)性樣品中的病毒載量及HPV16的整合狀態(tài)

2.2 標(biāo)本DNA的提取和質(zhì)量控制 依據(jù)所提取標(biāo)本DNA的電泳條帶，說明DNA濃度比較均一如圖1A。以293細(xì)胞DNA為模板的陽(yáng)性對(duì)照，其PCR產(chǎn)物為290 bp，55例標(biāo)本DNA經(jīng)內(nèi)參β-actin擴(kuò)增后得到與陽(yáng)性對(duì)照相一致的電泳條帶，如圖1B。說明所提標(biāo)本DNA都能滿足進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)要求。

依據(jù)E2與 E6的比值，確定HPV16的整合狀態(tài)。32例HPV16陽(yáng)性標(biāo)本中，檢測(cè)到有2例(6.3%)標(biāo)本E2基因沒被破壞，E2與E6的比值大于一，HPV16呈游離狀態(tài);3例沒有檢測(cè)到E2基因，9.4% 是完全整合狀態(tài)，E2與E6的比值等于零;27例檢測(cè)到E2與E6的比值大于零而小于一，84.4% 既有整合又有游離的病毒存在;并且在游離與整合的混合型中，有21例整合型多于游離型(表2)。提示32例HPV16陽(yáng)性食管癌樣品中，病毒DNA與宿主基因整合很普遍。

圖1 食管癌樣品中DNA質(zhì)量檢測(cè)

3討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)病毒存在狀態(tài)的原理：HPV整合時(shí)，E2中心區(qū)域“絞鏈區(qū)”因其不穩(wěn)定性而成為HPV整合入宿主細(xì)胞最常見的HPV缺失或斷裂部位，而E6和E7 ORF及長(zhǎng)控區(qū)(LCR)常保持完整〔4〕。因此，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，選擇HPV16 E2區(qū)的三個(gè)不同部位設(shè)計(jì)引物，即HPV16 E2起始區(qū)2 755～2 942，“絞鏈區(qū)”3 355～3 526，接近終點(diǎn)區(qū)3 602～3 786區(qū)設(shè)計(jì)引物，這樣設(shè)計(jì)的引物可真實(shí)地反映HPV16的缺失或斷裂部位，從而可真實(shí)地反映整合狀態(tài)。根據(jù)這一原理，如HPV以游離型形式存在，E2與E6拷貝數(shù)比例相等;如HPV整合型在宿主染色體中，E2缺失，E2與 E6拷貝數(shù)比例為零;如HPV以游離和整合的混合型形式存在，E2的拷貝數(shù)少于E6。E2與E6比率代表HPV整合狀態(tài)。因此，可通過E2/E6比值觀察HPV基因組在宿主染色體上的整合情況。在本項(xiàng)研究中，為使E2與E6的比率準(zhǔn)確的反映HPV的整合狀態(tài)，我們?cè)谠O(shè)計(jì)E2的引物時(shí)，分別選擇了三個(gè)不同的區(qū)域，即E2基因的兩端和中心區(qū)域。

我們用含有看家基因β-actin、HPV16 E2全長(zhǎng)及E6～E7的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行β-actin、HPV E2及E6基因的定量。結(jié)果顯示，三條標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.95，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性好，符合標(biāo)準(zhǔn)曲線定量法的要求。因而，我們能夠?qū)PV16 E2和E6基因進(jìn)行準(zhǔn)確的定量。

通過實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)人看家基因β-actin含量，及每例樣品中E6含量，可估測(cè)出HPV的病毒載量(包括游離和整合)。通過計(jì)算每例標(biāo)本HPV16E6的拷貝數(shù)與β-actin的拷貝數(shù)之比，計(jì)算得到HPV16的拷貝數(shù)。32例樣品中，大約每個(gè)細(xì)胞含有0.066～65.2拷貝數(shù)。這一范圍的病毒載量與宮頸上皮內(nèi)瘤變病毒載量(每個(gè)細(xì)胞大于8 000拷貝)〔5〕相比，顯然是很低的，因而需用較靈敏的方法才能檢測(cè)到。

雖然在宮頸上皮瘤變中，瘤變的進(jìn)程與HPV整合到宿主染色體的病毒載量相關(guān)〔6〕，但在一些HPV陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞系中，有較低的病毒載量，如SiHa細(xì)胞系中，每個(gè)細(xì)胞中HPV16的拷貝數(shù)為1～2拷貝〔7〕，HeLa細(xì)胞系中，每個(gè)細(xì)胞中HPV18的拷貝數(shù)為10～50拷貝〔8〕。結(jié)合我們研究的結(jié)果，推測(cè)在一些食管癌中雖然病毒載量較低，但當(dāng)病毒與宿主基因組整合后，改變了其他基因的結(jié)構(gòu)與功能，低病毒載量仍可導(dǎo)致或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

本研究提示在食管癌組織中，HPV16大多以游離和整合的混合形式存在，但整合型所占比例多于游離型。Si等〔8〕用熒光PCR方法研究了35例HPV16陽(yáng)性標(biāo)本的整合狀態(tài)，其結(jié)果表明，2例為完全整合、3例為完全游離、30例為游離和整合同時(shí)存在。提示在食管癌組織標(biāo)本中HPV DNA與宿主細(xì)胞基因的整合很普遍。這些結(jié)果進(jìn)一步說明，HPV感染可能是食管癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因子，食管癌發(fā)生與HPV感染有關(guān)。

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