重組鈣調(diào)蛋白及其突變體蛋白的分離純化及活性鑒定

何桂林，郭 鳳，封 瑞，胡慧媛，邵冬雪，郝麗英

(中國醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 藥物毒理教研室，遼寧 沈陽 110001)

重組鈣調(diào)蛋白及其突變體蛋白的分離純化及活性鑒定

何桂林，郭 鳳，封 瑞，胡慧媛，邵冬雪，郝麗英

(中國醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 藥物毒理教研室，遼寧 沈陽 110001)

目的 建立一種簡單穩(wěn)定高效分離純化體外重組鈣調(diào)蛋白(CaM)及其突變體蛋白的方法。方法 將CaM及其三種鈣結(jié)合位點(diǎn)突變體的cDNA插入pGEX-6p-3質(zhì)粒載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，大量培養(yǎng)并利用異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)CaM及其突變體的GST融合蛋白表達(dá)，GS-4B beads進(jìn)行分離純化。采用SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白純度和相對(duì)分子質(zhì)量;采用Bradford方法測(cè)定純化后蛋白濃度;采用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)純化后蛋白的活性。結(jié)果 純化的CaM及突變體蛋白具有較高的純度;CaM及突變體蛋白得到了大量表達(dá);純化后蛋白可恢復(fù)已“run-down”心肌細(xì)胞膜鈣通道的活性。結(jié)論 本研究成功建立了一種穩(wěn)定高效簡單的重組CaM及其突變體蛋白的分離純化方法，為深入研究CaM的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

鈣調(diào)蛋白;GST;突變體;膜片鉗

鈣調(diào)蛋白(Calmodulin，CaM)廣泛存在于各種真核細(xì)胞中，通過與Ca2+結(jié)合從而直接或間接調(diào)節(jié)多種重要生理功能，例如調(diào)節(jié)各種酶的活性，肌肉收縮和舒張，神經(jīng)系統(tǒng)功能以及基因表達(dá)等［1-3］。CaM蛋白分子質(zhì)量為17．6 kD，由148個(gè)氨基酸組成，空間結(jié)果呈啞鈴狀，兩端呈球形，中間由細(xì)長的α-螺旋結(jié)構(gòu)連接，兩端各有兩個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)。CaM突變體是指CaM某些關(guān)鍵氨基酸殘基改變后，使得CaM與Ca2+結(jié)合能力喪失。一般認(rèn)為CaM與Ca2+形成CaM-Ca2+復(fù)合物而具有多種生理學(xué)功能［4-5］，CaM突變體也廣泛應(yīng)用于CaM自身調(diào)節(jié)特性及生物學(xué)作用的機(jī)制研究。

傳統(tǒng)CaM提取方法十分復(fù)雜，且產(chǎn)量小，純度低，提取成本高［6］，并且無法獲得 CaM 突變體，因此，嚴(yán)重限制了相關(guān)研究。本研究將CaM及Ca2+結(jié)合位點(diǎn)突變的突變體CaM12，CaM34，CaM1234的cDNA插入pGEX-6p-3質(zhì)粒載體，利用異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，在大腸桿菌(E．coli)BL21(DE3)表達(dá)重組 CaM、CaM12、CaM34和 CaM1234的GST融合蛋白。利用能識(shí)別并特異性結(jié)合GST的Glutathione-Sepharose 4B beads(GS-4B beads)純化CaM及其突變體蛋白，并采用膜片鉗技術(shù)［7］檢驗(yàn)其活性。

1 材料與方法

1．1 材 料

pGEX-6p-3/CaM、pGEX-6p-3/CaM12(E31A+E67A)、pGEX-6p-3/CaM34(S101F+E140A)、pGEX-6p-3/CaM1234(E31A+E67A+S101F+E140A)質(zhì)粒均由日本鹿兒島大學(xué)Kameyama教授惠贈(zèng);IPTG、溶菌酶、氨芐西林(Amp)均購自Sigma公司;PreScission Protease與GS-4B beads購自GE Healthcare公司;其他試劑均購自BIOSHARP公司。

1．2 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化及鑒定

1．2．1 BL21感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 采用42℃精確熱擊法進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。分別取pGEX-6p-3/CaM、pGEX-6p-3/CaM12、pGEX-6p-3/CaM34與pGEX-6p-3/CaM1234各5 ng，分別加入 E．coli BL21 50 μL，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴30 min，置42℃水浴60 s，然后快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻2 min。分別加入無菌SOC培養(yǎng)基(胰化蛋白胨20 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 8．5 mmol/L，KCl 2．5 mmol/L，MgCl210 mmol/L，葡萄糖 20 mmol/L)1 mL，混勻后置37℃搖床150 r/min震蕩培養(yǎng)1 h，4 000 r/min離心2 min，吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其加到含Amp 0．1 g/L的LB固體瓊脂培養(yǎng)板(胰化蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 85．5 mmol/L，瓊脂粉15 g/L)上，用無菌的彎頭玻棒輕輕將細(xì)胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37℃培養(yǎng)12～16 h。

1．2．2 提取質(zhì)粒 經(jīng)含Amp 0．1 g/L的瓊脂平板37℃過夜篩選后，取單克隆菌種接種于裝有含Amp 0．05 g/L的 LB培養(yǎng)液 3 mL的試管中，37℃、120 r/min震搖培養(yǎng)12～16 h。取菌液 1．5 mL(其余用20%甘油－20℃保存)，15 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清;加冰預(yù)冷的堿裂解液Ⅰ250 μL，劇烈渦旋使細(xì)菌沉淀重懸并完全分散;加新配制的堿裂解液Ⅱ250 μL，混勻;加冰預(yù)冷的堿裂解液Ⅲ350 μL，混勻，置冰上3～5 min;4℃，15 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至另一離心管中;加等體積的酚-氯仿(1∶1)，振蕩混合有機(jī)相和水相，4 ℃，15 000 r/min離心2 min，取上清，加2倍體積的無水乙醇于室溫沉淀DNA，振蕩混合，室溫放置2 min;4℃，15 000 r/min離心10 min，棄上清，收集沉淀;加70%乙醇溶液 1 mL，振搖，4℃，15 000 r/min離心2 min，回收DNA;室溫自然干燥10～15 min使酒精揮發(fā);用1×TE重新溶解核酸，溫和振蕩數(shù)秒鐘，－20℃貯存。取部分再次用1×TE稀釋一定比例后，測(cè)質(zhì)粒DNA吸光度(A)值，稀釋到500 ng/μL。

1．2．3 酶切鑒定 重組質(zhì)粒存在兩個(gè) ECoRⅠ酶切位點(diǎn)，選用限制性內(nèi)切酶ECoRⅠ酶切鑒定，反應(yīng)體系:RE 緩沖液1 μL，ECoRⅠ0．25 μL，質(zhì)粒 DNA 1 μL，DEPC 水 7．75 μL，反應(yīng)總體系 10 μL。37 ℃孵育1 h后，1．2%的瓊脂糖凝膠電泳。

1．3 蛋白表達(dá)及純化

1．3．1 融合蛋白表達(dá) 取適量保留菌種加入裝有LB培養(yǎng)液(含Amp 50 mg/L)400 mL的錐形瓶中，37℃，120 r/min振搖培養(yǎng)12～16 h。當(dāng) A595值在0．6～1．0之間時(shí)，加入 IPTG 至 1 mmol/L，37 ℃，120 r/min振搖培養(yǎng)4 h，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。

1．3．2 CaM及突變體蛋白純化［8］所有操作均在冰上進(jìn)行，所有離心均在4℃進(jìn)行。菌液5 000 r/min離心10 min，棄上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)20 mL重懸沉淀菌體，加入溶菌酶至1 g/L，室溫放置5～10 min;放入液氮中冰凍后再放入超聲中溶解，反復(fù)10次，打破菌體，釋放蛋白。16 000 r/min離心10 min，取上清，加 GS-4B beads 600 μL，置水平搖床室溫輕搖1 h。400 r/min離心5 min，棄上清。各管加入 PBS 2 mL，400 r/min，離心5 min，棄上清，洗 3～5次。各管加入PBS 495 μL和PreScission Protease 5 μL，混勻后置水平搖床振搖5 h。400 r/min離心5 min，上清即是提純的CaM或CaM突變體蛋白，－80℃凍存。

1．4 純化后蛋白鑒定

1．4．1 CaM及CaM突變體純度鑒定 常規(guī)15%SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化的 CaM、CaM12、CaM34和CaM1234純度及相對(duì)分子質(zhì)量。

1．4．2 CaM及CaM突變體基因序列鑒定 將保存的菌液送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1．4．3 CaM及CaM突變體濃度測(cè)定 參照Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒方法測(cè)定CaM、CaM12、CaM34和CaM1234濃度。

1．4．4 蛋白活性鑒定 膜內(nèi)向外記錄模式記錄純化后CaM及CaM突變體對(duì)“run down”L-型鈣通道的恢復(fù)作用，分離單個(gè)豚鼠心室肌細(xì)胞［9］。采用膜片鉗細(xì)胞貼附模式及膜內(nèi)向外模式記錄單通道鈣電流。

2 結(jié)果

2．1 純化CaM及CaM突變體鑒定

2．1．1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 質(zhì)粒pGEX-6P-3第953號(hào)堿基開始為ECoRⅠ酶切位點(diǎn)，CaM及突變體第33號(hào)堿基開始為ECoRⅠ酶切位點(diǎn)，質(zhì)粒pGEX-6P-3經(jīng)SalⅠ和NotⅠ雙酶切插入CaM后，重組后的質(zhì)粒兩個(gè)ECoRⅠ酶切位點(diǎn)大概相距40個(gè)堿基。重組質(zhì)粒經(jīng)ECoRⅠ酶切后，應(yīng)該有兩個(gè)堿基片段，分別為40和5 390 bp(pGEX-6P-3質(zhì)粒4 983 bp加上CaM的450 bp減去另一長度為40 bp堿基片段)，其中因40 bp堿基片段太小，酶切經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后丟失，因此，理論上瓊脂糖凝膠電泳圖上只在大約5 400 bp出現(xiàn)條帶。重組質(zhì)粒經(jīng)ECoRⅠ酶切后電泳，在約5 400 bp有一條帶，結(jié)果與理論值相符。

2．1．2 純化后蛋白15%SDS-PAGE電泳鑒定 結(jié)果顯示，在表觀分子質(zhì)量約18 kD處出現(xiàn)一條蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，未見其他明顯的雜蛋白條帶，純度較高，見圖1。初步認(rèn)為提純獲得 CaM、CaM12、CaM34、CaM1234蛋白。

2．2 CaM及CaM突變體測(cè)序鑒定

圖1 純化后CaM及突變體蛋白SDS-PAGE圖Fig．1 SDS-PAGE of purification CaM and mutant

為進(jìn)一步鑒定CaM及突變體，測(cè)序結(jié)果與Blast軟件比對(duì)，CaM測(cè)序結(jié)果與Homo sapiens calmodulin 2(phosphorylase kinase，delta)(CALM2)完全一致;CaM12測(cè)序結(jié)果顯示與 Homo sapiens calmodulin 2(phosphorylase kinase，delta)(CALM2)基因序列比對(duì)，在 Homo sapiens calmodulin 2(phosphorylase kinase，delta)(CALM2)基因序列的第163和271個(gè)堿基由A突變成C，相應(yīng)所對(duì)應(yīng)的第31和67個(gè)氨基酸殘基均由E突變成A;CaM34測(cè)序結(jié)果顯示與Homo sapiens calmodulin 2(phosphorylase kinase，delta)(CALM2)基因序列比對(duì)，在Homo sapiens calmodulin 2(phosphorylase kinase，delta)(CALM2)基因序列的第372個(gè)堿基由A突變成T、第373個(gè)堿基由G突變成T、第490個(gè)堿基由A突變成C，其中前兩個(gè)堿基的共同突變使其相對(duì)應(yīng)第101個(gè)氨基酸殘基由S突變成F，最后一個(gè)堿基的突變使其相對(duì)應(yīng)的第140個(gè)氨基酸殘基由E突變成A;CaM1234測(cè)序結(jié)果顯示以上提到的堿基均發(fā)生相同的突變。

2．3 CaM及CaM突變體濃度測(cè)定

采用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒方法測(cè)定提純蛋白濃度，CaM、CaM12、CaM34和 CaM1234濃度分別為 0．855，0．874，1．025 和 1．626 g/L。

2．4 CaM 及 CaM 突變體對(duì)“run down”L-型鈣通道的恢復(fù)作用

以細(xì)胞貼附模式記錄到的電流作為對(duì)照，細(xì)胞膜片被鉗制下來后置于細(xì)胞內(nèi)液(IO)后(膜內(nèi)向外模式記錄電流)，鈣電流迅速減小，發(fā)生“run down”。置于事先加有 CaM、CaM12、CaM34以及 CaM1234的給藥孔后，均可使電流活性恢復(fù)。

3 討論

CaM在體內(nèi)行使非常廣泛而重要的生理、病理作用，調(diào)節(jié)許多酶的活性，其中不少是關(guān)鍵酶。CaM與Ca2+形成CaM-Ca2+復(fù)合體后，與酶作用，激活酶，從而調(diào)節(jié)生理生化反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，CaM在腦內(nèi)的表達(dá)增強(qiáng)或結(jié)構(gòu)改變可增強(qiáng)大腦的長期記憶功能。CaM拮抗劑的研究是現(xiàn)代藥理學(xué)中一項(xiàng)十分重要的課題，研究發(fā)現(xiàn)抗精神病藥物通過拮抗CaM而產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的療效;以CaM為靶蛋白，可以用于抗腫瘤治療;降低CaM水平，可治療銀屑病等［10-12］。

本研究結(jié)果表明，重組DNA可順利轉(zhuǎn)化入E．coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，在含Amp的固體LB培養(yǎng)板上可大量生長;基因重組的E．coli可大量穩(wěn)定表達(dá)GST-CaM及其突變體融合蛋白，且在轉(zhuǎn)化和表達(dá)的過程中，CaM及相關(guān)突變體基因性狀穩(wěn)定;Glutathione-Sepharose 4B可順利識(shí)別并穩(wěn)定結(jié)合GSTCaM、GST-CaM12、GST-CaM34、GST-CaM1234融合蛋白;PreScission Protease特異性酶切后，獲得的CaM及相關(guān)突變體蛋白經(jīng)膜片鉗實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)證明具有生理活性。

本研究提取質(zhì)粒并用EcoRⅠ酶切鑒定轉(zhuǎn)化成功;用SDS-PAGE電泳確定純化后的體系有目的蛋白(CaM、CaM12、CaM34、CaM1234)，無其他雜蛋白;測(cè)序結(jié)果顯示CaM及其突變體蛋白基因序列完全正確;使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定純化后蛋白濃度均較高;以上蛋白均可一定程度上恢復(fù)已“run down”L-型鈣通道。綜上，采用本研究方法可穩(wěn)定獲得高純度高濃度并具有生物活性的CaM及相關(guān)突變體蛋白，為后續(xù)深入研究CaM及其突變體蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 呂茲聞，董秀蘭．鈣調(diào)蛋白、鈣調(diào)蛋白激酶與癲癇［J］．社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志，2008，6(1):39-41．

［2］ 楊麗亞，高 蒔．鈣調(diào)蛋白的藥用研究［J］．西北藥學(xué)雜志，2008，23(2):124-125．

［3］ Yang D，Song L S，Zhu W Z，et al．Calmodulin regulation of excitation-contraction coupling in cardiac myocytes［J］．Circ Res，2003，92(6):659-667．

［4］ Lee A，Zhou H，Scheuer T，et al．Molecular determinants of Ca2+/cahnodulin-dependent regulation of Cav2．1 channels［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(26):16059-16064．

［5］ Hailing D B，Aracena-Parks P，Hamilton S L．Regulation of voltage-gated Ca2+channels by calmodulin［J］．Sci Sigualing，2006，2006(318):er1．

［6］ Gopalakrishna R，Anderson W B．Ca2+-induced hydrophobic site on calmodulin:application for purification of calmodulin by phenyl-Sepharose affinity chromatography［J］．Biochem Biophys Res Commun，1982，104(2):830-836．

［7］ Guo F，Minobe E，Yazawa K，et al．Both N and C-lobes of calmodulin are required for Ca2+-dependent regulations of Cav1．2 Ca2+channels［J］．Biochem Biophys Res Commun，2010，391(2):1170-1176．

［8］ Han DY，Minobe E，Wang W Y，et al．Calmodulin and Ca2+-dependent facilitationand inactivation of the Cav1．2 Ca2+channels in guinea-pig ventricular myocytes［J］．J Pharmacol Sci，2010，112(3):310-319．

［9］ Yazawa K，Kaibara M，Ohara M，et al．An improved method for isolating cardiac myocytes useful for patch-clamp studies［J］．Jpn J Physiol，1990，40(1):157-163．

［10］顧 香，陳陽關(guān)，張杰敏．鈣調(diào)蛋白結(jié)構(gòu)及其神經(jīng)生物學(xué)功能的研究進(jìn)展［J］．重慶醫(yī)學(xué)，2008，37(17):1995-1997．

［11］程 沽，朱 毅，李忠仁．鈣調(diào)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與腦缺血再灌注腦損傷關(guān)系的研究［J］．中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010，8(7):836-838．

［12］孫益蘭，胡申江，王利宏，等．急性心肌梗死大鼠鈣調(diào)蛋白的改變及卡維地洛的干預(yù)作用［J］．中國病理生理雜志，2005，21(6):1085-1089．

Purification and identification of recombinant calmodulin and mutant

HE Gui-lin，GUO Feng，F(xiàn)ENG Rui，HU Hui-yuan，SHAO Dong-xue，HAO Li-ying
(Department of Pharmaceutical Toxicology，Pharmacy School of China Medical University，Shenyang 110001，China)

Purpose To establish a stable，rapid and effective method for the purification of calmodulin(CaM)and its mutants．Methods Escherichia coli BL21 competent cells were transformed with pGEX-6p-3 plasmid vector，which was inserted with the cDNAs of CaM and its mutants．The transformed BL21 cells were incubated，and stimulated with IPTG to express GST fusion proteins of CaM and its mutants．The fusion proteins were purified with Glutathione-Sepharose 4B beads．SDS-PAGE was used to detect the purity and relative molecular weight of CaM and its mutants．Bradford method was used to determine the concentration of purification CaM and its mutants，and the plasmids made a sequence analysis．The protein activity was examined by patch-clamp technique．Results SDS-PAGE showed the high purity of CaM and its mutants．The concentration of CaM and its mutants was around 1 mg/mL，which was enough for molecular biological and electrophysiological studies．The CaM and its mutants purified by this method could reverse run-down of L-type Ca2+of guinea pig cardiac myocytes．Conclusion A stable，rapid and effective method for the purification of calmodulin and its mutants was found，which provided the basis for further researches on CaM's biological functions．

calmodulin;GST;mutant;patch-clamp technique

R962;Q51

A

1005-1678(2012)06-0743-04

2011-12-27

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No．30870907，No．81001429，NO．31071004)

何桂林，女，博士生，E-mail:jxheguilin@126．com;郝麗英，女，通信作者，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:離子通道藥理學(xué)、藥物毒理學(xué)，E-mail:hao_liying@yahoo．com．cn。