生物信息資源在恥垢分枝桿菌EmbB多克隆抗體制備中的應用

張文利，馬 莉，辛 毅，徐躍飛，任 風，馬郁芳，2

(1.大連醫(yī)科大學，2.遼寧省糖生物學與糖生物工程重點實驗室，遼寧 大連 116044)

生物信息資源在恥垢分枝桿菌EmbB多克隆抗體制備中的應用

張文利1，馬 莉1，辛 毅1，徐躍飛1，任 風1，馬郁芳1，2

(1.大連醫(yī)科大學，2.遼寧省糖生物學與糖生物工程重點實驗室，遼寧 大連 116044)

目的 建立通過生物信息學手段制備恥垢分枝桿菌(M.smegamatis)EmbB(Sm EmbB)多克隆抗體的方法。方法 應用生物信息資源在Sm EmbB的N端尋找一段18個氨基酸的特異短肽，合成后將其與白喉類毒素分子相連，以所形成的復合物免疫動物制備抗Sm EmbB的多克隆抗體。結果 Western blot結果顯示獲得的抗體可特異地作用于Sm EmbB。結論 通過生物信息學手段制備多克隆抗體方法的建立解決了對蛋白質功能研究中缺乏抗體的困擾，為特殊蛋白質的抗體制備提供了借鑒。

恥垢分枝桿菌;EmbB;生物信息;多克隆抗體

細胞壁是分枝桿菌所特有的結構，對細菌的生命、形態(tài)、毒性傳播等非常重要。分枝桿菌細胞壁中具有兩種主要成分［1-2］，即 mAGP(mycolic acid-arabinogalactan-petidoglycan)和LAM(lipoarabinomannan)。mAGP是由分枝菌酸、阿拉伯聚糖半乳聚糖和肽聚糖三種成分組成，是細胞壁的核心成分，直接影響了細胞壁的完整性。LAM為分枝桿菌細胞壁中另一種主要成分，主要由與細胞質膜相連的肌醇脂、甘露聚糖和阿拉伯聚糖三種成分組成，它與細菌的生命形態(tài)沒有直接相關性，但與細菌導致的免疫應答及毒性傳播等有關。阿拉伯聚糖是細胞壁中兩種主要成分中共有的重要組成成分，在維持細胞壁的完整性及毒性方面起著重要作用。阿拉伯聚糖的生物合成是由多種糖基轉移酶參與完成的，目前已知有五種糖基轉移酶，即 EmbA、EmbB、EmbC、AftA和Rv1805，參與了分枝桿菌細胞壁中阿拉伯聚糖的生物合成［3-6］。其中EmbB和EmbA共同負責聚阿拉伯糖末端分支的合成［6-7］，具體功能與機制正在研究中。此外，EmbB也和抗結核藥物乙胺丁醇的耐藥菌株產生有關，資料表明EmbB基因的突變可導致抗乙胺丁醇耐藥菌株產生［8-10］。

EmbB在保持細菌細胞壁完整性、免疫以及抗結核藥物耐受性方面的影響，使其研究意義日益凸顯。但是，目前從蛋白質水平對其研究甚少，一方面是由于市場上尚無針對分枝桿菌EmbB的特異性抗體出售;另一方面，由于EmbB為膜蛋白，且分子質量大，表達很困難，迄今為止沒有表達并純化的Em-bB蛋白產生，因而也不能通過表達純化的蛋白免疫動物而獲得其相應的抗體。抗體的缺乏限制了對它的研究，目前只能借助一系列的化學分析手段，分析蛋白質缺失后對聚阿拉伯糖結構變化的影響。然而由于聚糖結構非常復雜和相似，現有的分析手段對它的分析也是有限的。基于此，本文以恥垢分枝桿菌(M.smegamatis，Sm)的 EmbB(Sm EmbB)作為研究對象，采用一種新的方法去獲得Sm EmbB的抗體:即應用生物信息學的方法，在Sm EmbB上尋找一段特異的約20個氨基酸的短肽，將其與一個大的免疫源片斷連接，進而以此免疫復合物免疫動物而獲得抗Sm EmbB的多克隆抗體。

1 材料

瓊脂糖和LB培養(yǎng)基(Invitrogen/GIBCO公司);卡那霉素和潮霉素(Sigma公司);預染的蛋白質分子質量標準(Fermentas公司);硝酸纖維素膜(Pall公司);偶聯堿性磷酸酶的馬抗小鼠IgG抗體(北京中衫金橋生物技術有限公司);5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)、氮藍四唑鹽酸鹽(NBT)(Roche公司)。

高速低溫離心機和超速低溫離心機(美國貝克曼公司);JY92-Ⅱ型超聲波細胞破碎機(寧波海曙科生儀器廠);JM-250型電泳儀、MV-Ⅱ型垂直板電泳槽、ST-2型半干式轉移電泳儀(大連競邁生物科技有限公司)。

清潔級8～12周齡雌性非孕 Balb/C小鼠，大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(遼)2008-0002。

2 方法

2.1 預測 EmbB 蛋白

從專業(yè)的微生物基因組數據庫(TIGR)中獲取Sm EmbB序列信息，利用各種生物信息學資源對Sm EmbB進行預測，包括二級結構及模序預測、跨膜情況分析、序列的相似性比對分析，從而確定候選的短肽序列，計算候選肽段的疏水性參數，在整個基因組中進行相似性分析，并最終確定該短肽。短肽的合理設計與正確的選擇對于制備有效而特異的Sm EmbB抗體是非常關鍵的。

2.2 短肽復合物的合成及抗血清的獲取

將已選擇的短肽進行人工合成，并通過橋接分子馬來酸咪唑葵?；?N-羥琥珀酰亞胺與大分子化合物白喉類毒素相連接形成可用于免疫動物的大分子復合物;選用生長狀態(tài)良好的8～12周齡雌性非孕Balb/C小鼠，用含有人工合成短肽的大分子復合物對小鼠進行免疫注射，共免疫3次，每隔2周再加強免疫注射1次，1周后采用摘眼球法采集血液，將抗血清在－20℃冰箱保存。

取血后，分離血清并用間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定抗血清的滴度，以合成的含有Sm EmbB N端約20個氨基酸的短肽復合物包被ELISA板過夜，洗滌后加入獲得的抗血清孵育2 h，洗滌之后加入堿性磷酸酶偶聯的抗小鼠 IgG抗體進行孵育，之后以4-硝基苯磷酸二鈉顯色并測定其在405 nm波長處的吸光度值。

2.3 抗血清特異性鑒定

2.3.1 菌株及其生長條件 實驗過程中所用到的embA基因敲除(ΔembA)、embB基因敲除(ΔembB)和embC基因敲除(ΔembC)的Sm菌株(M.smegmatis mc2155)均生長在含有25μg/mL那霉素的LB液體或固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)。攜帶表達有野生型Sm embB基因及具有點突變的Sm embB基因的embB基因敲除的Sm菌株則生長在含有25μg/m卡那霉素和50μg/mL潮霉素的LB液體或固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)。野生型Sm則生長在不含有任何抗生素的LB液體或固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)。

2.3.2 膜蛋白的提取及 Western Blot鑒定 生長并收獲至對數生長后期的上述相應的Sm菌液2 L，用超聲方法破碎細菌(工作60 s，間歇90 s，10個循環(huán))后，4℃，15 000 r/min離心1 h收集上清;在4℃，55 000 r/min離心上清 2 h，沉淀即為細胞膜蛋白;用BCA試劑盒測定總蛋白濃度，取膜蛋白樣品50μg進行10% ～20%梯度SDS-PAGE電泳，電泳完畢后進行轉膜，應用免疫小鼠獲得的抗血清進行免疫印記顯色。以含有引入了野生型embB基因及其embB點突變的Sm以及野生型的Sm，embA、embB、embC基因敲除的Sm以及野生型Sm為樣品，對免疫血清的特異性進行檢測。

3 結果與討論

3.1 對EmbB蛋白的預測

從 TIGR 基因組數據庫(http://cmr.jcvi.org/cgi-bin/CMR/CmrHomePage.cgi)中獲取 Sm EmbB蛋白序列，它是由1 093個氨基酸組成，分子質量為117.978 kD。對所獲得的EmbB氨基酸序列進行下面的分析:① 膜蛋白情況分析。首先將此序列在SOSUI等網站上對其進行跨膜分析，如圖1所示，Sm EmbB為跨膜蛋白，有13個跨膜區(qū)，根據圖1的序列信息將跨膜區(qū)標出，如圖2所示被方框所框的斜體灰色部分所示。膜蛋白的跨膜結構域多由一些疏水性的氨基酸組成，故這些結構域的部分不能作為短肽的候選部分;② 相似性分析。對Sm EmbB序列分析表明，它與另外兩種阿拉伯糖基轉移酶Sm EmbA和Sm EmbC同源性很高，因而分別從TIGR上獲取Sm EmbA和Sm EmbC的氨基酸序列，并將這三種基因間進行相似性比對分析，將大約20個氨基酸且序列相似性低的部分標出(圖2中下劃線部分);③計算疏水性參數。計算被選中的短肽中的氨基酸疏水性參數，選取其中極性大的肽段作為候選;④BLAST分析。將候選肽段在TIGR中對所有基因組進行相似性比對分析，選取其中沒有與其它基因組具有相似性或相似性很低的肽段。通過一系列的分析、預測，位于Sm EmbB氨基端、背景為灰色加重表示的18個氨基酸的肽段“SGEDAGKLQRTGYPDPNL”被選擇(如圖2所示)，送該肽段序列到生物公司進行化學合成和拼接。

圖1 SOSUI網站對EmbB膜蛋白的預測Fig.1 The prediction of EmbB by SOSUI

圖2 Sm EmbB跨膜結構分析以及可能的短肽候選序列Fig.2 The analysis on trans-membrane region and possible peptide candidates of Sm EmbB

3.2 Western blot方法鑒定多克隆抗體

應用合成的短肽復合物免疫小鼠，獲得血清;應用ELISA方法測定抗血清的抗體滴度，選用1∶2 000的稀釋抗體進行后續(xù)的抗體特異性驗證。

本研究中設計并合成的小分子短肽，由于分子質量小，不足以激起機體的免疫應答，因而將其與一個大分子的白喉類毒素相拼接，借助于白喉類毒素的免疫應答作用而產生相應的抗體。由于白喉類毒素的分子質量很大，為避免短肽結構的抗原決定簇被白喉類毒素覆蓋，本研究中應用了馬來酸咪唑葵酰基-N-羥琥珀酰亞胺作為橋接的“分子臂”而將兩段肽段連接，希望目的短肽能隨著白喉類毒素的免疫應答作用而能產生相應的目的抗體。上述ELISA檢測確認有相應的抗血清產生，但產生的抗血清是否能特異地作用于Sm EmbB，仍需進一步的證實。本研究中應用Western blot方法對其進行確認。

提取各種相關Sm的膜蛋白，用10% ～20%SDS-PAGE梯度膠進行電泳，電泳完畢后將其從SDS-PAGE膠轉移到硝酸纖維素膜上，用獲得的血清作為抗體對膜進行孵育，之后用偶聯有堿性磷酸酶的抗鼠IgG孵育，并用NBT/BCIP顯色。結果如圖3所示。從圖3中可知，野生型的Sm在約120 kD附近都有一條較弱的的條帶產生，與預期的Sm EmbB蛋白的大小(117.978 kD)一致，這是來自于基因組上Sm EmbB蛋白的表達;而此120 kD處的條帶在embB基因敲除的菌株內不能被檢測出，這與預期的結果一致，同時也說明本研究室所獲得的embB基因敲除的菌株內Sm EmbB確已不存在;當在embB基因敲除的恥垢分枝桿菌中引入功能性或點突變的Sm的embB基因，由于表達載體上強啟動子的驅動(上述的基因均構建在pVV16載體上，這些基因的表達均受到pVV16上強啟動子-Phs60的驅動，可產生過表達的基因產物)，使Sm EmbB蛋白過表達，其表達量明顯多于細菌體內的自然狀態(tài)，故在120 kD附近都有明顯的條帶產生;但從圖3結果中可見，除了在120 kD附近的條帶之外，在小分子的位置也有其它條帶被檢出，但條帶的強度較弱，這是由于由小鼠抗血清得到的抗體為多克隆抗體(霍亂類毒素也能產生其相應的抗體)，因而也能與其它的蛋白質呈現色反應，但是從Western blot的結果可知，在120 kD附近的條帶強度隨著自然狀態(tài)的Sm EmbB或過表達的Sm EmbB的有無而表現出有無或強弱，故可說明該抗體能特異地作用于Sm EmbB。因此，盡管有非特異條帶的存在，仍不影響對該抗體能夠特異性作用于Sm EmbB蛋白的認定。通過Western blot方法的檢測，可確認通過用生物信息資源獲得的Sm EmbB短肽，通過與大分子的霍亂類毒素連接后，能夠免疫動物而獲得能作用于Sm EmbB的多克隆抗體，并可將此抗體用于對Sm EmbB蛋白的研究。

圖3 應用 Western blot對EmbB多克隆抗體的鑒定(膜蛋白樣品均來自于相應的Sm)Fig.3 Identification of EmbB polycolonal antibody by Western blot analysis(Lane 1-6 are membrane proteins from M.smegmatis)

目前也可通過基因克隆的方法制備多克隆抗體［11］。即將目的蛋白克隆并表達，經親和色譜純化后作為免疫源去免疫動物而得到相應的多克隆抗體。在本研究中免疫的后續(xù)過程是與通過基因工程的方法獲取多克隆抗體是一致的，但不同在于免疫源的制備。本研究中的對象為Sm中的EmbB蛋白，它分子質量大，且具有超過10次的跨膜結構域，因而它的表達是非常困難的。事實上，我們也嘗試過不同的表達載體和表達菌株，但即使在包涵體中也沒有能檢測到含有EmbB的融合蛋白的表達，因而也不可能通過上述基因工程的方法獲得相應的多克隆抗體。基于此，本研究中嘗試選取Sm EmbB蛋白中一小段有特異性的肽，人工合成這段小肽，并將其與一個大分子物質相連接而構建出具有免疫源性的復合物，去制備相應的抗體，并成功獲得了抗Sm EmbB抗體。

4 結論

本文應用生物信息資源在Sm EmbB的N端上尋找一段特異性的短肽，并基于此短肽制備它的多克隆抗體。Sm EmbB蛋白多克隆抗體的成功產生，不僅為對Sm EmbB的研究提供了有利的工具，同時也為對其它缺乏特異性抗體的蛋白質的研究提供了新思路:即可利用生物信息手段在研究對象上尋找一段特異的短肽，依據此短肽獲得它相應的多克隆抗體。隨著蛋白質組學的發(fā)展，蛋白質功能的重要性已經越來越為人們所重視，因此對蛋白質的直接研究尤為重要。而對于功能未知的、新的蛋白質的研究，能夠擁有特異性檢測它的抗體是非常重要的，且是很必要的;特別是不能通過基因操作技術而得到表達的這樣一類蛋白質，經常由于缺少相應的特異性抗體而限制了對它的研究。在此，本文建立了這種新的抗體制備方法，解決了對一些蛋白質功能研究中缺乏抗體的困擾，為在蛋白質水平的研究提供了新的思路和手段。雖然本文制備的是Sm EmbB的多克隆抗體，但相信對其它蛋白質的抗體制備也有一定的指導和借鑒意義。

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Application of bioinformation in achieving polycolonal antibody of EmbB in M.smegmatis

ZHANG Wen-li1，MA Li1，XIN Yi1，XU Yue-fei1，REN Feng1，MA Yu-fang1，2
(1.Dalian Medical University，2.Glycobiology and Glycoengineering Key Lab of Liaoning Province，Dalian 116044，China)

Purpose To build up a new method to make polycolonal antibody of EmbB in M.smegmatis by utilizing bioinformation resource.Methods A peptide of Sm EmbB with 18 amino acids was designed based on to the analysis of bioinformation，and linked with Diphtheria Toxoid to form a complex which was utilized to immune mouse for getting Sm EmbB's polycolonal antibody.Results The antibody achieved can work on Sm EmbB well with being identified by Western blot.Conclusion This method can provide a new point of view to obtain polycolonal antibody for a certain protein without antibody available.

M.smegmatis;EmbB;bioinformation;polycolonal antibody

Q785

A

1005-1678(2012)06-0732-04

2011-12-07

遼寧省高等學校創(chuàng)新團隊支持計劃(LT2010026)

張文利，女，副教授，微生物的糖生物化學及分子生物學，Tel:0411-86110312，E-mail:zhwenli2004@yahoo.com.cn; 馬郁芳，通信作者，教授，博士生導師，Tel:0411-86110338，E-mail:yufang_ma@hotmail.com。