利用反向膠束技術(shù)從微紫青霉菌中提取木聚糖酶的初步研究

任 敬

(石家莊醫(yī)學高等?？茖W校 基礎部 生化教研室，河北 石家莊 050071)

利用反向膠束技術(shù)從微紫青霉菌中提取木聚糖酶的初步研究

任 敬

(石家莊醫(yī)學高等?？茖W校 基礎部 生化教研室，河北 石家莊 050071)

目的 利用反向膠束技術(shù)從微紫青霉菌中提取木聚糖酶。方法 采用雙-2-乙基己基硫代琥珀酸鈉(AOT)異辛烷反膠束溶液萃取和反萃取由微紫青霉菌產(chǎn)生的木聚糖酶，探討水相pH值、離子強度、AOT濃度等因素對分離效率的影響。結(jié)果 當AOT濃度為0.6 mol/L，萃取pH 6.0，NaCl濃度為 0.1 mol/L，反萃取 pH 8.0，NaCl濃度為0.5 mol/L，15%乙醇時，該體系從微紫青霉菌澄清發(fā)酵液中提取木聚糖酶，萃取率接近100%，反萃取率也在80%以上。木聚糖酶酶比活從27 U/mg提高到208 U/mg，提高了6.7倍，且粗酶純化后的比活在200 U/mg以上。結(jié)論 采用此體系提取木聚糖酶具有較好的工業(yè)前景。

木聚糖酶;反膠束;萃取;反萃取;雙-2-乙基己基硫代琥珀酸鈉

木聚糖酶是一類降解木聚糖分子的復雜酶系，其來源廣泛，結(jié)構(gòu)復雜，本身也是一種多功能酶，其用途廣泛［1］。

分離純化木聚糖酶多采用非特異性方法，如硫酸銨沉淀后，采用離子交換、凝膠色譜分離純化;也有根據(jù)特異性分離的方法，如根據(jù)木聚糖酶能與底物特異性結(jié)合而發(fā)展的親和色譜等［2］，這些方法都存在操作時間長，不易放大的缺點［3］。反膠束是表面活性分子在非極性有機溶劑中自發(fā)形成的具有熱力學穩(wěn)定性的納米級聚集體，其內(nèi)部形成“水池”，可以溶解水和其他親水分子(蛋白質(zhì)等)［4］。反向膠束系統(tǒng)的液液萃取技術(shù)在蛋白質(zhì)的分離純化方面具有高效、選擇性強和連續(xù)性好的特點［5］。且近期研究表明表面活性劑雙-2-乙基己基硫代琥珀酸鈉(AOT)反向膠束萃取方面具有很大的潛力［6］。采用甘蔗渣渣漿酸水解液作為培養(yǎng)環(huán)境在Palma等［7］的研究中已經(jīng)被提到過，然而未見后續(xù)報道。本文嘗試采用反膠束相轉(zhuǎn)移法萃取和反萃取法提取木聚糖酶，探討提取的最優(yōu)條件。

1 材料

微紫青霉菌，中國科學院微生物研究所;樺木木聚糖(90%木糖)、AOT(純度 ＞99%)、3，5-二硝基水楊酸，Sigma公司;其余化學試劑皆為市售分析純。

XW-80A微型渦旋混合儀，上海滬西分析儀器廠;TG1650-WS離心機，上海盧湘儀儀器廠;722分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。

2 方法

2.1 微生物與生長環(huán)境

微紫青霉菌在包含2%葡萄糖、0.25%酵母提取物、2%瓊脂以及基于Vogel's培養(yǎng)基的2%的濃鹽溶液的培養(yǎng)基上30℃連續(xù)培養(yǎng)5 d。菌株所產(chǎn)生的孢子被懸浮于水中，懸浮液通過置于錐形瓶上的篩絹(200目)進行過濾，獲得孢子濃度為105/mL。

2.2 甘蔗渣渣漿酸水解液的制備

干甘蔗渣800 g與0.25%硫酸溶液8 L混合，將混合液在121℃下高壓蒸煮45 min后將高壓處理過的水解液過濾，除去不溶物，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 至 5.5。

2.3 木聚糖酶的制備

培養(yǎng)用培養(yǎng)基由甘蔗渣渣漿水解液以及基于Vogel's培養(yǎng)基的2%的濃鹽溶液和0.1%的酵母提取物構(gòu)成。培養(yǎng)基采用112℃，15 min熱壓消毒，后倒入125 mL錐形瓶中進行培養(yǎng)。每一個錐形瓶倒入培養(yǎng)基25 mL。培養(yǎng)環(huán)境為:溫度30℃、初始pH 5.5、60 r/min 振蕩培養(yǎng)96 h。

2.4 萃取與反萃取

2.4.1 發(fā)酵液初次酶活測定 在對澄清發(fā)酵液實施萃取與反萃取之前，需對澄清發(fā)酵液中所包含的木聚糖酶進行一次活性的測定，以此作為確定萃取收率與反萃取收率的參考。

2.4.2 萃取與反萃取 通過存在于異辛烷中的AOT反向膠束系統(tǒng)，酶被從澄清的發(fā)酵液中提取出來，整個過程包含兩個步驟。在第一步當中，木聚糖酶溶液4 mL與等體積膠束微乳液(AOT反向膠束存在于異辛烷中)進行混合，通過加入磷酸緩沖液調(diào)節(jié)水相的pH。通過強烈的渦旋5 min，使兩相的分配達到平衡。離心處理(3 000 r/min，5 min)，使兩相分開，測定水相中酶的活性，計算萃取收率。第二步則是取包含木聚糖酶的有機相2 mL與水相(1 mol/L 醋酸緩沖液，pH 5.5，含 0.5 mol/L NaCl)2 mL混合，同時加入15%的乙醇，渦旋5 min，使之充分混合;通過離心(3 000 r/min，5 min)最終將酶從膠束中轉(zhuǎn)移到水相中。測定水相中酶的活性，計算反萃取收率。

2.4.3 酶活性的測定 取0.5%樺木木聚糖溶液(用 pH 4.6，50 mmol/L 醋酸緩沖液配制)1 mL，加入酶液0.5 mL，55℃保溫30 min后加入DNS試劑3 mL終止反應，然后在沸水浴中煮15 min。冷卻，加水至25 mL，混勻，于550 nm波長處比色，用煮沸20 min的酶液作對照。活性單位是在50℃下，每1 min每1 mL酶液水解木糖1μmol所相當?shù)拿噶浚?］。

3 結(jié)果和討論

3.1 萃取時間的影響

利用反向膠束系統(tǒng)從微紫青霉菌發(fā)酵液中提取木聚糖酶的萃取率以及反萃取率與萃取時間的關(guān)系見表1。萃取和反萃取均在2 min內(nèi)即可達到平衡，故本實驗所有的數(shù)據(jù)都是在混合時間大于2 min的條件下取的，以確保數(shù)據(jù)的準確性。

表1 渦旋混合時間的影響

3.2 AOT 的影響

配制不同濃度的AOT反向膠束溶液，對微紫青霉菌發(fā)酵澄清液進行萃取與反萃取。其中反向膠束系統(tǒng) NaCl濃度為0.1 mol/L，pH 為6.0。

從圖1中可以看出，在較低濃度時，萃取率隨著AOT濃度的增加而迅速提高?？赡苁且驗樵黾颖砻婊钚詣┑臐舛葧狗聪蚰z束的聚集數(shù)增加，還能增加反向膠束相整體的極性，從而增加酶蛋白增溶到反向膠束中的機會。當AOT濃度達到0.6 mol/L時，萃取率可達95%以上。

圖1 AOT濃度對萃取率的影響萃取(萃取C NaCl=0.1 mol/L，pH 6.0)

當AOT濃度超過0.6 mol/L時，萃取率變化趨勢趨于平緩，并且萃取后水相出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可能是因為表面活性劑濃度相對酶濃度已經(jīng)達到飽和，通過增加有機相中的表面活性劑已經(jīng)不能顯著的改善萃取的效果。并且過多的表面活性劑會直接導致其從有機相中的析出，以至于發(fā)生乳化的現(xiàn)象。因此，實驗選擇的最適表面活性劑AOT濃度為0.6 mol/L。

3.3 水相pH的影響

水相pH值的變化對萃取率有明顯的影響。如圖2所示，在pH 5.0～6.0的范圍內(nèi)，反向膠束體系對木聚糖酶有很高的萃取率，都達到了90%以上。并且隨著pH的降低，萃取率逐漸升高，最高接近100%。pH值對萃取率的影響主要表現(xiàn)在改變蛋白質(zhì)的表面電荷及其對構(gòu)象的改變。pH值決定了酶蛋白帶電基團的解離速率和所帶的靜電荷。靜電作用是萃取的主要作用力，在pH＜pI時，酶蛋白帶正電荷，和陰離子表面活性劑極性頭互相吸引。pI和pH的差值越大，靜電作用越強，萃取效果越好。

圖2 萃取水相pH值對萃取率與反萃取率的影響(C AOT=0.6 mol/L，萃取 C NaCl=0.1 mol/L，反萃取 C NaCl=0.5 mol/L，pH 8.0，乙醇體積分數(shù) 15%)

萃取水相pH對反萃取率的影響見圖2。在pH＞6.0時，隨pH下降，反萃取率不斷增加，在6.0時達到峰值，在pH＜6.0時，反萃取率反而下降?？赡苁且驗檩腿r，pH和pI的差值越大，酶和表面活性劑極性頭間的靜電引力就越大，結(jié)合就越牢固，導致在反萃取時不容易分開。

我們注意到pH值在2.9以下時，有機相中將出現(xiàn)穩(wěn)定的乳狀物，對于木聚糖酶的提取將無法進行。另一方面，當pH值大于9.8時酶蛋白將在水相與有機相的交界處以沉淀的形式析出。對于以上觀察到的現(xiàn)象我們認為，這可以歸因于酶蛋白與表面活性劑形成了復合結(jié)構(gòu)，從而導致其變性。

3.4 鹽濃度的影響

圖3顯示了不同鹽濃度對木聚糖酶萃取率的影響。當鹽濃度較低時，木聚糖酶幾乎全部被萃取;當鹽濃度高于一定值時，萃取率迅速下降，并且在很窄的范圍內(nèi)從100%迅速降到0，所以離子強度對蛋白質(zhì)萃取率的影響相當強烈。一個相對低的離子強度的條件對于木聚糖酶的萃取無疑是有利的，但是離子強度并不是越低越好，在很低的鹽濃度時，水相乳化嚴重。并且鹽濃度越高，分相越快越清晰。

圖3 鹽濃度對萃取率以及反萃取率的影響(C AOT=0.6 mol/L，萃取 pH=6.0，反萃取 pH 8.0，乙醇體積分數(shù) 15%)

我們同時還注意到在反萃取過程中鹽濃度的變化對于反萃取率的改變不甚明顯。在這里我們主要考慮的是實驗方案的經(jīng)濟程度以及反萃取過程的分相效率問題。

3.5 反萃取中乙醇的影響

陳霖杰［9］在對用AOT/異辛烷反向膠束體系從胰酶粗提物中萃取胰蛋白酶進行的研究中指出，通過在反向膠束相加入乙醇可以解決反向膠束萃取蛋白質(zhì)時使蛋白質(zhì)變性失活的問題，胰蛋白酶的前萃取率達到90%，反萃取率接近100%。

我們在實驗中注意到如果反萃取時不加入乙醇，幾乎得不到有活性的酶，加入乙醇，使木聚糖酶的反萃取率得到了明顯的提高。究其原因，可能是因為乙醇的加入使得蛋白質(zhì)和反向膠束內(nèi)表面之間的作用減弱，從而使蛋白質(zhì)更易從反向膠束中遷移出來，同時減少酶和表面活性劑極性頭之間強烈的靜電作用而導致的蛋白質(zhì)變性。此外，乙醇的加入也使得萃取之后的分相變得更加容易。但過量乙醇的加入，會導致反萃取率下降。其原因可能是因為乙醇改變蛋白質(zhì)的電荷特性，引起其沉淀析出。根據(jù)圖4結(jié)果，確定乙醇的體積分數(shù)為15%。

圖4 反萃取中乙醇對反萃取率的影響(C AOT=0.6 mol/L，萃取 C NaCl=0.1 mol/L，pH=6.0，反萃取 C NaCl=0.5 mol/L，pH 8.0)

3.6 木聚糖酶初酶的純化

對于存在于微紫青霉菌澄清發(fā)酵液中的初酶，按照最佳條件:CAOT=0.6 mol/L，萃取 CNaCl=0.1 mol/L，pH 6.0;反萃取 CNaCl=0.5 mol/L，pH 8.0，乙醇體積分數(shù)15%，進行萃取與反萃取，萃取率為93%，反萃取84%，比活從27 U/mg提高到208 U/mg，提高了6.7倍。一步從微紫青霉菌發(fā)酵液中分離出木聚糖酶，反向膠束技術(shù)取得了較好的效果，為以后進一步的精提做好了準備。

利用該體系提取木聚糖酶還有以下特點:一步就可以從粗酶中提取到較純的木聚糖酶，提取時間短，提取可在室溫下進行，AOT廉價易得，有機溶劑可循環(huán)使用。本體系的粗酶來源簡單，產(chǎn)量豐富，所運用的培養(yǎng)基方便易得且經(jīng)濟成本相對低廉，可以為工業(yè)生產(chǎn)提供良好的基礎。

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［9］陳霖杰.用乙醇消除AOT/異辛烷反膠束體系萃取過程中蛋白質(zhì)的變性失活［D］.上海:華東理工大學，2005.

Extracting xylanase from Penicillium janthinellum using AOT-reverse micellar systems

REN Jing
(Biochemical Department of Shijiazhuang Medical College，Shijiazhuang 050071，China)

TQ464.8

A

1005-1678(2012)02-0167-03

2011-11-21

任 敬，女，本科，助教，研究方向:生化教學。