一株具有羽毛降解活性的益生菌的篩選和應(yīng)用

龔一軒，張桂敏，馬立新

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062)

羽毛是鳥類和禽類表皮細(xì)胞角質(zhì)化的衍生物，其中蛋白質(zhì)含量高達(dá)90%[1].動(dòng)物的大量消費(fèi)產(chǎn)生許多羽毛廢棄物，傳統(tǒng)處理方法主要為填埋、焚燒，造成了羽毛蛋白資源的浪費(fèi).羽毛中蛋白主要是角蛋白，因含大量二硫鍵，交聯(lián)成復(fù)雜的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有良好的穩(wěn)定性和難溶性，在一般自然環(huán)境中很難將其降解[2].目前羽毛的降解并再利用的途徑有物理降解法、化學(xué)降解法、酶降解法和微生物降解法[3].盡管物理、化學(xué)方法研究較早，但存在破壞氨基酸結(jié)構(gòu)、產(chǎn)物單一以及產(chǎn)物穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)[4].用化學(xué)法更是會(huì)在生產(chǎn)中產(chǎn)生大量的鹽使產(chǎn)品適口感較差[5].目前羽毛降解用酶因?yàn)楸磉_(dá)量低[6-7]、生產(chǎn)成本過高、降解效率低等原因尚未工業(yè)化應(yīng)用，利用微生物對(duì)廢棄羽毛進(jìn)行降解便成為一種較為合適的選擇.利用微生物來(lái)降解廢棄羽毛已有很多報(bào)道[8-10]，但是這些微生物降解羽毛產(chǎn)生的小肽也大多被微生物自身所利用，如果降解菌株不是有用的菌體，那么這些羽毛蛋白還是被白白浪費(fèi)掉.也有從羽毛腐爛物中分離到地衣芽孢桿菌降解羽毛的報(bào)道[11]，但是，環(huán)境中分離的地衣芽孢桿菌也需要做一系列的安全性評(píng)價(jià)，才能作為安全微生物用于生產(chǎn).

益生菌可調(diào)整菌群失調(diào)達(dá)到防病的目的，可促使機(jī)體產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)、殺滅致病菌，而且益生菌產(chǎn)生的抗活性物質(zhì)，具有獨(dú)特的生物奪氧作用機(jī)制，能抑制致病菌的生長(zhǎng)繁殖[12].但目前尚少見利用益生菌降解廢棄羽毛并獲得益生菌產(chǎn)品的報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)從市售的益生菌中篩選出能高效降解羽毛的地衣芽孢桿菌，從羽毛的前處理、接種量、培養(yǎng)基的成分、發(fā)酵時(shí)間及產(chǎn)物成分多角度優(yōu)化羽毛降解工藝，得到一種利用益生菌高效降解羽毛獲得菌肽新型飼料添加劑的工藝流程.

1 材料與方法

1.1供試材料市售益生菌；羽毛，由菜場(chǎng)收購(gòu)；LB液體培養(yǎng)基：0.5%酵母粉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，全文同)，1%蛋白胨，1%NaCl，水；羽毛篩選培養(yǎng)基：2%羽毛，1%NaCl，水；優(yōu)化羽毛發(fā)酵培養(yǎng)基：2%羽毛，0.3%硝酸鉀，0.1%磷酸氫二鉀，0.06%磷酸二氫鉀，0.04%六水氯化鎂，0.5% NaCl，0.1%山梨醇，水[10].

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的篩選 選購(gòu)4種市售的單一益生菌，分別為：蘇柯漢牌的短小芽孢桿菌、蘇柯漢牌的乳酸菌、動(dòng)物飼料添加劑牌的枯草芽孢桿菌及科諾公司生產(chǎn)的地衣芽孢桿菌，并將其編號(hào)為HUBM1、HUBM2、HUBM3、HUBM4.將上述4種產(chǎn)品溶于無(wú)菌水，并分別在固體LB平板上分區(qū)劃線活化并獲得單菌落.次日，挑單菌落接種至250 mL錐形瓶中，瓶?jī)?nèi)含50 mL羽毛篩選培養(yǎng)基，在37 ℃，200 r/min的條件下?lián)u瓶發(fā)酵，觀察對(duì)比這些菌株發(fā)酵降解羽毛的效果，挑選出降解羽毛效率最高的菌株.

1.2.2 菌株的鑒定 抽提該菌染色體DNA，并以該DNA為模板，利用正向引物：27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCT)和反向引物1492R(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，1 min 30 s；72 ℃，7 min.將PCR產(chǎn)物膠內(nèi)回收送出測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過BLAST同源比對(duì)[13]鑒定菌種.

1.2.3 羽毛最適預(yù)處理方法研究 分別用4種方法處理同一批羽毛，A為羽毛經(jīng)粉碎處理；B為羽毛用121 ℃高溫處理30 min；C為羽毛在0.02%NaOH溶液中沸水浴15 min；D為羽毛同時(shí)經(jīng)過0.02%NaOH沸水浴15 min及121 ℃高溫處理30 min.用這4種經(jīng)過不同預(yù)處理的羽毛分別配制成羽毛篩選培養(yǎng)基.接入HUBM2，并在37 ℃，200 r/min的條件下?lián)u床發(fā)酵，觀察羽毛降解效果.

1.2.4 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 在250 mL的錐形瓶中分別配制100 mL的羽毛篩選培養(yǎng)基(A)、LB培養(yǎng)基+2%羽毛(B)和優(yōu)化羽毛發(fā)酵培養(yǎng)基(C)，接種菌株HUBM2，在37 ℃，200 r/min的條件下培養(yǎng)，觀察各培養(yǎng)基羽毛的狀態(tài)，測(cè)定菌體的變化量、羽毛降解率及可溶性蛋白和小肽含量.

1.2.5 最佳接種量的優(yōu)化 接種一環(huán)HUBM2于100 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min的條件下?lián)u瓶發(fā)酵12 h，做為種子液.配制4瓶100 mL羽毛篩選培養(yǎng)基于250 mL錐形瓶中，將上述種子液分別按5%、10%、15%、20%的菌液接種.其中5%和10%比例的采用菌液接種，直接接種種子液于羽毛發(fā)酵培養(yǎng)基；15%和20%比例的采用菌體接種，是將菌液收集至50 mL滅菌離心管，5 000 r/min離心8 min后棄上清將菌體沉淀接種至羽毛篩選培養(yǎng)基.將接種好的培養(yǎng)基置于37 ℃，200 r/min的條件下培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基形態(tài)變化.

1.2.6 最大降解率的測(cè)定 用電子天平稱量濾紙質(zhì)量m1.將最佳效果的搖瓶培養(yǎng)的羽毛發(fā)酵液稀釋3倍，用玻璃棒引流至裝了之前稱量的濾紙的漏斗中.在此過程中不斷往漏斗中加水稀釋，并用玻璃棒攪拌，確保菌體和殘余羽毛能夠完全分離.待全部發(fā)酵液過濾完后，將濾紙連同濾渣一同放入60 ℃烘箱內(nèi)烘干至質(zhì)量不再減少，稱得總質(zhì)量m2.培養(yǎng)基中添加羽毛的總含量為m3.羽毛降解率按公式：降解率P=1-(m2-m1)÷m3×100%計(jì)算.

1.2.7 益生菌活菌數(shù)的測(cè)定 分別取1 mL接種后的培養(yǎng)基和發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液，編號(hào)A、B.采用平板稀釋菌落計(jì)數(shù)法，將A、B液分別用無(wú)菌水進(jìn)行10倍的梯度稀釋至10-5～10-7.將每個(gè)稀釋度分別取100 μL涂布兩塊LB平板，放入37 ℃培養(yǎng)過夜.次日統(tǒng)計(jì)每塊平板的菌體數(shù)，取菌體數(shù)在30～200個(gè)之間的平板為有效樣品，求平均菌體數(shù).最后根據(jù)梯度稀釋的倍數(shù)推算出100 μL菌液的菌體數(shù)含量，進(jìn)而計(jì)算出發(fā)酵液中總的活菌體數(shù).

1.2.8 可溶性蛋白或小肽含量測(cè)定 用Bradford法[14]測(cè)量發(fā)酵上清可溶性蛋白或小肽的含量，用蒸餾水配制0.5 mg/mL的小牛血清蛋白做為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.取發(fā)酵初末兩個(gè)狀態(tài)的發(fā)酵液1 mL，離心取上清，編號(hào)a、b.在96孔板中A行依次分別加入0、1、2、4、8、12、16、20 μL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用蒸餾水補(bǔ)齊至20 μL，在B、C行重復(fù)2次，共3組.在96孔板中D行依次分別加入2、4、8、16、20 μL a、b樣品，用蒸餾水補(bǔ)齊至20 μL，在E，F(xiàn)行重復(fù)兩次，共3組.在上述每個(gè)孔補(bǔ)加200 μL G250工作液，37 ℃反應(yīng)2 min后，將96孔板放入酶標(biāo)儀在595 nm波長(zhǎng)下讀數(shù).利用A、B、C 3行的數(shù)據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出a、b兩個(gè)樣品的可溶性蛋白及小肽含量.

2 結(jié)果與分析

2.1羽毛降解益生菌的篩選與鑒定4種市售的益生菌經(jīng)過7 d的培養(yǎng)后觀察，降解羽毛效果最好的菌株是HUBM2.抽提HUBM2菌株的染色體DNA，PCR擴(kuò)增其16SrDNA編碼序列，測(cè)序結(jié)果通過BLAST進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果顯示該益生菌與多個(gè)Bacilluslicheniformis菌株的16SrDNA編碼序列一致性為100%，其中已報(bào)道的是BacilluslicheniformisATCC14580[15]，因?yàn)榈匾卵挎邨U菌是FDA認(rèn)定的安全微生物，加之分離自已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化的益生菌，因此，鑒定菌株HUBM2是地衣芽孢桿菌.

2.2羽毛預(yù)處理方法對(duì)羽毛降解的影響按方法1.2.3中所述，4瓶發(fā)酵物搖床培養(yǎng)7 d后觀察結(jié)果，如圖1所示.由圖1可以看出B方法利用高溫處理的羽毛降解效果略好于A方法經(jīng)粉碎處理的效果，而通過C方法稀堿煮的羽毛的降解效果要遠(yuǎn)好于B和A方法，而用兩種方法綜合處理的D方法的羽毛降解效果和用C方法稀堿煮的羽毛的降解效果相差無(wú)幾.而羽毛一經(jīng)粉碎后，體積特別大，操作不方便.因此，稀堿煮處理羽毛能夠有效地破壞羽毛中的二硫鍵及其空間結(jié)構(gòu)，使羽毛變得更加容易被降解，而且可操作性強(qiáng).

圖1 4種不同羽毛預(yù)處理方法發(fā)酵5 d后的形態(tài)

2.3不同培養(yǎng)基對(duì)羽毛降解效果的影響按方法1.2.4中所述，分別接種HUBM2到3種不同的培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)5 d后觀察結(jié)果，測(cè)定羽毛降解率、可溶性小肽和氨基酸含量、菌體生長(zhǎng)量，結(jié)果如表1所示.由表1可以看出，益生菌HUBM2在優(yōu)化培養(yǎng)基能夠最好地將羽毛降解.由于羽毛培養(yǎng)基中沒有可溶性的碳氮源，而剛接種的菌體處在遲緩期，所以發(fā)酵前期生長(zhǎng)極其緩慢，因此A培養(yǎng)基中的生物量在5天時(shí)增長(zhǎng)量很少且羽毛降解的也很少.LB培養(yǎng)基，菌體生長(zhǎng)得很快然而羽毛的降解卻幾乎沒有，原因可能是由于菌體優(yōu)先利用了LB培養(yǎng)基中的碳氮源.

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)羽毛降解效果的影響

表2 不同接種量和種子對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

2.4接種量對(duì)羽毛降解的影響按方法1.2.5中所述，不同接種量的4瓶發(fā)酵物搖床培養(yǎng)2～5 d，每天觀察羽毛降解狀態(tài)，如表2所示.由表2可以看出接種10%菌液的羽毛降解效果最好，而接種種子液的發(fā)酵樣品降解羽毛的效果要明顯好于接種菌體時(shí)降解羽毛的效果.這可能一是因?yàn)榫褐羞€有殘存的LB培養(yǎng)基，二是菌體處于對(duì)數(shù)期，因此使轉(zhuǎn)接后的遲緩期縮短.

2.5最佳發(fā)酵條件下的發(fā)酵相關(guān)結(jié)果利用摸索好的條件：使用0.02%NaOH溶液沸水浴處理15 min

表3發(fā)酵前后活菌體數(shù)及可溶性蛋白含量的變化

發(fā)酵前發(fā)酵后活菌體數(shù)/CFU4×10102×1012可溶性蛋白含量/(mg/mL)00．41

圖2 發(fā)酵始末菌體形態(tài)變化

的羽毛，以優(yōu)化羽毛發(fā)酵培養(yǎng)基為發(fā)酵底物，按10%的接種量接種益生菌HUBM2菌液，在37 ℃，200 r/min的條件下發(fā)酵48 h.測(cè)定樣品發(fā)酵液菌體數(shù)變化及發(fā)酵液上清可溶性蛋白質(zhì)及小肽含量變化.結(jié)果如表3.由表3可知益生菌利用羽毛做為唯一碳氮源，活菌體數(shù)從接種時(shí)的4×1010CFU增加到2×1012CFU，增長(zhǎng)了50倍左右.可以看出，可溶性蛋白和小肽含量從完全沒有而達(dá)到0.41 mg/mL.因此益生菌降解羽毛，利用羽毛降解蛋白自身增殖的同時(shí)，也有少量可溶性蛋白和小肽未被利用.

2.6發(fā)酵始末菌體形態(tài)變化如圖2A發(fā)酵初期菌體都為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，且數(shù)量較少；發(fā)酵中期菌體數(shù)明顯增加，出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和芽孢共存的情況，且可以看見較大的羽毛碎片；發(fā)酵末期(圖2B)菌體幾乎全為芽孢形態(tài)，且數(shù)量明顯增多，未見明顯的羽毛碎片.由于芽孢的抗逆性極強(qiáng)，能耐高溫，當(dāng)發(fā)酵液中的菌體大多以芽孢形式存在時(shí)，為發(fā)酵液的后處理和制備新型菌肽飼料添加劑提供了長(zhǎng)期保藏的基礎(chǔ).

3 討論

本研究利用市售益生菌對(duì)羽毛進(jìn)行生物降解，該菌較之其他益生菌有較強(qiáng)的降解羽毛的能力，它有效地解決了廢棄羽毛的處理問題并得到含有大量益生菌及可溶性的蛋白質(zhì)和短肽的發(fā)酵液，該發(fā)酵液經(jīng)過噴霧干燥后可制備含有益生菌和蛋白肽的新型飼料添加劑.在發(fā)酵條件的優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)羽毛經(jīng)過稀堿處理和提高降解的效率，一般來(lái)說(shuō)，酸堿處理會(huì)引起環(huán)境污染，但是本研究采用的是0.02%的稀堿溶液，廢液采用稀酸中和后，可以用普通的活性污泥法處理即可排放.按10%的接種量接種種子液，經(jīng)過約48 h的發(fā)酵可將羽毛基本降解，羽毛降解率約80%，發(fā)酵液呈灰褐色，發(fā)酵液中生物量達(dá)到較高水平，可溶性蛋白也達(dá)到峰值，芽孢桿菌絕大多數(shù)變?yōu)檠挎?將發(fā)酵液通過紗網(wǎng)濾去固形羽毛殘余物后，加入填充劑，噴霧干燥后得到含有大量益生菌、少量的可溶性蛋白或短肽的新型飼料添加劑.

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