固定化培養(yǎng)對球等鞭金藻生長及其提取物的抑菌效果影響研究

宋文軍，王雪青，付秀娟

（a.天津商業(yè)大學 生物技術與食品科學學院，天津 300134；b.天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

固定化培養(yǎng)對球等鞭金藻生長及其提取物的抑菌效果影響研究

宋文軍，王雪青，付秀娟

（a.天津商業(yè)大學 生物技術與食品科學學院，天津 300134；b.天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

分別選用液體懸浮培養(yǎng)、海藻酸鈣固定培養(yǎng)和海藻酸鈉－殼聚糖－海藻酸鈉（Alginate－chitosan－alginate，ACA）微膠囊法對球等鞭金藻（Isochrysisgalbana）進行培養(yǎng)，考察不同培養(yǎng)方法對藻細胞生長的影響以及藻細胞經(jīng)磷酸緩沖液、體積分數(shù)95%的乙醇溶液、甲醇與甲苯的混合液（體積比為3∶1）、乙酸乙酯、丙酮5種溶劑提取的提取物對金黃色葡萄球菌（S.aureus）和大腸桿菌（Escherichiacoli）的抑菌活性.結果表明，ACA微膠囊法培養(yǎng)的藻細胞生長周期長，提取物中抑菌物質(zhì)含量高，抑菌效果最好.

固定化；海藻酸鈣；ACA微膠囊；球等鞭金藻；抑菌

微藻中富含大量蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，粗蛋白含量超過60%，生物學產(chǎn)量高于任何作物，已被應用到嬰兒食品、老年保健食品及營養(yǎng)補品中.由于微藻種類多、數(shù)量大、處于海洋食物鏈的基礎，因此也是篩選抗腫瘤藥物的庫源［1］，其提取物在抑菌方面的作用已有報道［2－4］.

球等鞭金藻（Isochrysisgalbana）是一種分布廣泛的海洋浮游單細胞藻類，屬于金藻門，金藻綱，等鞭金藻目，等鞭金藻科，等鞭金藻屬.經(jīng)常作為海產(chǎn)經(jīng)濟雙殼動物幼蟲良好的基礎餌料［5］，對某些海產(chǎn)動物幼蟲飼養(yǎng)效果非常好［6－7］.球等鞭金藻在生長過程中能合成多種生物活性物質(zhì)，如葉綠素a、葉綠素c、β－胡蘿卜素和葉黃素等色素以及多糖及不飽和脂肪酸等，尤其是細胞內(nèi)EPA和DHA等多不飽和脂肪酸的含量較高［8－9］.研究組從大量的海洋微藻中篩出了對腫瘤細胞系He La，B16－F10有明顯毒活性的微藻株：球等鞭金藻H29（Isochrysisgalbana29），該藻的甲醇和甲苯混合萃取物對大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯的抑菌效果，故頗具開發(fā)的潛力.但此藻個體微小，所用培養(yǎng)基鹽度大，不利于離心或過濾收集，而固定化培養(yǎng)有利于解決這一問題.

目前藻類固定化培養(yǎng)的主要方法分為載體法、吸附法、包埋法、共價鍵結合法和交聯(lián)法等.該研究以懸浮培養(yǎng)為對照，通過海藻酸鈣包埋法［10］和海藻酸鈉－殼聚糖－海藻酸鈉（Alginate－chitosan－alginate，ACA）液芯包囊法［11］對球等鞭金藻H29進行培養(yǎng)，測定其生長曲線，并且測定不同培養(yǎng)方法所得藻類提取物的抑菌活性.

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

殼聚糖（購自上?？ú┕べQ(mào)有限公司，經(jīng)本實驗室改性），海藻酸鈉（上海埃彼化學試劑有限公司），其它試劑均為國產(chǎn)分析純.

250D光照培養(yǎng)箱 （金壇市新航儀器廠），LW200 T多功能生物顯微鏡（上海測維光電技術有限公司），ZNCL－B磁力攪拌器（河南愛博特科技發(fā)展有限公司）.

1.2 藻種來源

球等鞭金藻 H29（Isochrysisgalbana29）（天津商業(yè)大學保藏菌種）.

1.3 培養(yǎng)條件

采用常規(guī)f／2［9］配方，接種為培養(yǎng)至對數(shù)期的藻種，接種量為105個／m L，溫度22℃，鹽度28，光照8 000 lx下進行培養(yǎng).

1.4 海藻酸鈣包埋法

首先將培養(yǎng)至對數(shù)期的藻液與海藻酸鈉溶液混合，混合后的溶液藻濃度約為105個／m L，海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)為2%.用4＃針頭注射器注射到質(zhì)量分數(shù)2%的氯化鈣溶液中，攪拌數(shù)分鐘，使海藻酸鈉液滴鈣化成球，進行培養(yǎng)，膠球濃度為3個／m L.培養(yǎng)后收集膠球，加入一定量的55 mmol／L檸檬酸鈉溶液解膠，定容后檢測藻體濃度.

1.5 ACA微膠囊的制備

首先將培養(yǎng)至對數(shù)期的藻液與海藻酸鈉溶液混合，混合后的溶液藻濃度約為105個／m L，海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)為2%.用4＃號針頭注射器注射到質(zhì)量分數(shù)2%的氯化鈣溶液中，攪拌數(shù)分鐘，使海藻酸鈉液滴鈣化成球.洗滌鈣化后的膠球，并將其轉(zhuǎn)移至質(zhì)量分數(shù)為1.5%的殼聚糖溶液中，反應10 min成膜.洗滌成膜后的膠球，再將其放入海藻酸鈉溶液中反應10 min，進行覆膜處理.洗滌包覆后的膠球，最后用55 mmol／L檸檬酸鈉溶液將膠球核液化，制成ACA生物微膠囊.最后微膠囊在3個／m L的濃度下進行培養(yǎng).

經(jīng)過培養(yǎng)后收集ACA微膠囊，然后機械破碎并收集上清液.微膠囊碎片用去離子水潤洗3次收集上清液，再將收集得到的上清液混合定容測藻體濃度.

1.6 藻體檢測

將定容后的藻液用血球計數(shù)板在顯微鏡下觀察藻細胞個數(shù)，計算藻細胞密度和生長率K［10］：

式中，N t為實驗進行td的細胞數(shù)目；N0為實驗初始的細胞數(shù)目.

1.7 藻體收集及物質(zhì)提取方法

將處理好的藻液經(jīng)5 000 r／min離心，棄去上清液，收集沉淀得到藻體，用冷凍干燥法得到凍干藻粉.進行研磨，過100目篩.

提取溶劑選用藻類物質(zhì)提取常用方法所采用的溶劑進行提取［12－15］.具體操作方法為：稱取5 g藻粉，分別加入100 m L 0.2 mol p H7.0磷酸緩沖液體積分數(shù)95%的乙醇溶液、甲醇與甲苯的混合液（體積比為3∶1）、乙酸乙酯、丙酮5種溶液，充分振蕩，放入冰箱中浸提3 d后取出，5 000 r／min離心收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制得藻體浸膏（樣品的旋蒸溫度為35℃）.浸膏中加入5倍體積去離子水繼續(xù)旋蒸，重復2次，去除有機溶劑.所得浸膏用去離子水潤洗，然后冷凍干燥.所得浸提物加二甲基亞砜（DMSO）充分溶解，配制成不同濃度溶液，過0.22μm膜除菌，放入冰箱備用.

1.8 抑菌實驗

該實驗所采用的受試菌為金黃色葡萄球菌（S aureus）和大腸桿菌（E.coli）.采用紙片法：制備濃度約為105個／m L的菌懸液，取20 m L菌懸液倒入300 m L溶化并已冷卻至40～45℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，搖勻后迅速分裝于培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿15 m L.待凝固后，將20μL各提取液加入已消過毒的圓形紙片（φ6 mm）上，略干后貼于培養(yǎng)基平板上，同時作各溶劑的空白對照，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，24 h）.培養(yǎng)完成后觀察結果，測量抑菌圈直徑.

2 結果與討論

2.1 生長曲線的測定

圖1為不同培養(yǎng)方法下藻細胞的生長曲線.

圖1 不同培養(yǎng)方法球等鞭金藻H29生長曲線Fig.1 Growth curves of Isochrysisgalbana 29 by using different culture methods

從圖1中可以看到，2種固定化培養(yǎng)的藻細胞生長狀況比懸浮培養(yǎng)的藻細胞生長狀況要滯后2 d左右，懸浮生長的速率明顯高于固定化細胞的生長速率.并且懸浮生長的藻細胞數(shù)量明顯高于固定法所得的藻量，ACA微膠囊法次之，海藻酸鈣包埋法最低.

實驗發(fā)現(xiàn)，懸浮培養(yǎng)法經(jīng)過第15 d后藻細胞進入衰亡期，生長量開始下降，而2種固定化培養(yǎng)的藻細胞仍處于生長平衡期.由此可知，固定化藻細胞生長周期長，生長較緩慢，具有較長的生產(chǎn)周期.這可能是因為：一方面營養(yǎng)物質(zhì)和光線進入膠球受到一定程度阻礙使其生長速率減緩；另一方面這種在較低生長速度下生長的藻細胞既減慢了營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，又降低了有害代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生速度這對于構建生物反應器，從中獲取活性物質(zhì)及種質(zhì)保存都是十分有利的.

2.2 抑菌實驗結果

表1為不同培養(yǎng)方法所得藻細胞采用不同溶劑浸取所得的浸出物對革蘭氏菌的抑菌效果.

表1 抑菌實驗結果Tab.1 Results of antibacterial experiment

從表1可以看到，不同培養(yǎng)方法所得的提取物對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑制作用均優(yōu)于對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑制作用.除水相提取物對金黃色葡萄球菌沒有抑菌作用外，其它有機溶劑所提取的物質(zhì)均對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑制作用.而在大腸桿菌的抑菌實驗中，只有甲醇／甲苯混合液、丙酮提取物對大腸桿菌有較強抑制作用.

不同溶劑提取物的抑菌效果也有所差別.從實驗得出，藻細胞的水相提取物均無抑菌效果，由此可知藻體的抗菌活性產(chǎn)物為非極性化合物.并且甲醇／甲苯混合液提取物的抑菌效果均優(yōu)于其它溶劑提取物.不同溶劑對藻細胞提取物抑菌活性的影響表明，在篩選具有抑菌活性的微藻時，要對多種有機溶劑進行考察，以選擇最合適的提取溶劑.

不同培養(yǎng)方式所得藻提取物的抑菌作用可由表1看出：2種固定化培養(yǎng)方法所得的藻提取物的抑菌效果均達到或高于懸浮式培養(yǎng)的效果.而2種固定化方法所得的藻提取物抑菌效果相近，且ACA微膠囊法效果略高于海藻酸鈣包埋法.這主要是由于固定化細胞相比游離培養(yǎng)生長周期長，營養(yǎng)物質(zhì)處于相對亞適量水平，延遲了藻細胞的衰老；并且由于ACA微膠囊菌體的代謝水平相比游離法較緩慢，在一定程度上降低了分解代謝的活性，有利于次級代謝產(chǎn)物的積累.

3 結論

對不同培養(yǎng)方法的藻細胞生長曲線進行了測定，并對不同培養(yǎng)方法所得的藻細胞提取物的抑菌效果進行了實驗.

結果表明：懸浮培養(yǎng)方式細胞生長速率快，細胞生長量高，但15 d后進入衰亡期.固定化培養(yǎng)方法藻細胞生長周期長，可以延遲衰老，有利于抑菌物質(zhì)積累.兩種固定化方法比較，ACA微膠囊方法細胞的生長率高于海藻酸鈣包埋法，20 d時藻體濃度為1.5×106個.

固定化培養(yǎng)的藻細胞提取物抑菌效果均優(yōu)于懸浮培養(yǎng)方法，2種固定化方法所得提取物抑菌效果相近.其中甲醇／甲苯提取物抑菌效果最高，在50 mg／m L質(zhì)量濃度下對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別達到12 mm和9 mm.

綜合分析球等鞭金藻H29的生長及其提取物抑菌效果2方面結果可以得出結論：ACA微膠囊方法固定化培養(yǎng)球等鞭金藻H29可以得到比較理想的效果，優(yōu)于傳統(tǒng)的懸浮培養(yǎng)方法.

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Study on effects of different culture methods on growth ofIsochrysisgalbanaand antibacterial activities of its extract

SONGWen－jun，WANGXue－qing，F(xiàn)UXiu－juan

（a.College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China；b.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，Tianjin 300134，China）

Suspension culture method，calcium alginate gel，alginate－chitosan－alginate（ACA）microcapsule are used to cultureIsochrysisgalbana，and the effects of different culture methods on the growth ofIsochrysisgalbanaare studied.Phosphate buffer，95%ethanol，methanol／toluene（3∶1，），ethyl acetate，acetone are used as solvent to extract antibacterial materials fromIsochrysisgalbana.S.aureusandEscherichiacoliare used as indicative bacteria to study the antibacterial activities of the extract fromIsochrysisgalbana.The results show thatIsochrysis galbanacultured by ACA microcapsule has long growth cycle，and the extract contains high levels of antibacterial materials and has good antibacterial activities.

immobilization；calcium alginate；ACA microcapsule；Isochrysisgalbana；antibacterial

Q938.8

A

1671－1114（2012）01－0070－04

2010－10－28

天津商業(yè)大學基金資助項目（090101Q）

宋文軍（1967—），副教授，博士，主要從事生物技術與食品科學方面的研究.

（責任編校 紀翠榮）