靈芝孢子粉對(duì)戊四氮活化海馬神經(jīng)細(xì)胞bcl-2表達(dá)的研究

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江佳木斯154007)

靈芝孢子粉對(duì)戊四氮活化海馬神經(jīng)細(xì)胞bcl-2表達(dá)的研究

張金波,王淑秋,張 虎,張淑紅,張玉萍,劉月霞

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江佳木斯154007)

癲癇是一種短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病,由于腦內(nèi)神經(jīng)元群過(guò)度放電所致的陣發(fā)性腦功能障礙。癲癇發(fā)作后可造成神經(jīng)元死亡,而細(xì)胞凋亡是癲癇發(fā)作后神經(jīng)元死亡的主要方式。靈芝孢子粉除了能清除自由基,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用、對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)還具有鎮(zhèn)靜和保護(hù)的作用。本實(shí)驗(yàn)研究靈芝孢子粉對(duì)戊四氮活化大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞bcl-2表達(dá)變化的影響,進(jìn)一步探討靈芝孢子粉的作用機(jī)制和癲癇與海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)控基因之間的關(guān)系。

癲癇;細(xì)胞凋亡;神經(jīng)元

癲癇是一種短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病,由于腦內(nèi)神經(jīng)元群過(guò)度放電所致的陣發(fā)性腦功能障礙[1]。癲癇發(fā)作后可造成神經(jīng)元死亡,而細(xì)胞凋亡是癲癇發(fā)作后神經(jīng)元死亡的主要方式。細(xì)胞凋亡是多個(gè)基因調(diào)控的過(guò)程,包括促凋亡基因和抗凋亡基因。近年來(lái)研究表明,bcl-2基因家族在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用。靈芝孢子粉除了能清除自由基,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用、對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)還具有鎮(zhèn)靜和保護(hù)的作用[2]。本實(shí)驗(yàn)研究靈芝孢子粉對(duì)戊四氮活化大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞bcl-2表達(dá)變化的影響,進(jìn)一步探討靈芝孢子粉的作用機(jī)制和癲癇與海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)控基因之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

戊四氮(PTZ)、瓊脂糖,(美國(guó)Sigma公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(寶生物工程有限公司);Trizol,美國(guó) Invitrogen公司;氯仿、異丙醇、溴乙錠(上海生工生物工程技術(shù)有限公司);Rnase抑制劑(美國(guó)AB I公司);Marker,寶生物工程(大連)有限公司;Taq DNA 聚合酶(寶生物工程有限公司);靈芝孢子粉(佳木斯市野生靈芝種植基地)等。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高速低溫離心機(jī),美國(guó)Sigma公司;醫(yī)用低溫冰箱,日本三洋電器有限公司;PCR儀,美國(guó)Thermo公司;PCR電泳儀,北京六一儀器廠;WH-851旋渦混合器,上海手術(shù)器械廠;GIS凝膠圖像處理系統(tǒng),上海天能科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供雄性、健康3～5月齡、體重(200±20)g的Wistar大鼠30只。隨機(jī)分成3組,分別是正常對(duì)照組、癲癇模型組和靈芝孢子粉用藥組,每組10只。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 癲癇模型制備

正常對(duì)照組用生理鹽水腹腔注射+生理鹽水灌胃;癲癇模型組用PTZ腹腔注射+生理鹽水灌胃;靈芝孢子粉組用PTZ腹腔注射+靈芝孢子粉灌胃。戊四氮用前以雙蒸水新鮮配制成溶液(10g/L),靈芝孢子粉用前以雙蒸水配制成溶液(濃度為30g/L)。致癲癇方法:每日上午11點(diǎn),灌胃前禁食6h。腹腔注射劑量為35mg/kg,灌胃劑量為150mg/kg,每日1次,持續(xù)28d。停藥1周,再用相同劑量的PTZ測(cè)試,凡獲連續(xù)5次Ⅱ級(jí)或Ⅱ級(jí)以上驚厥發(fā)作的大鼠為完全點(diǎn)燃的大鼠癲癇模型。

大鼠點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)及驚厥發(fā)作評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]:

0級(jí),無(wú)反應(yīng)或抽搐停止,沒(méi)有行為上的發(fā)作;Ⅰ級(jí),濕狗樣顫動(dòng),節(jié)律性嘴或面部抽動(dòng);Ⅱ級(jí),面部陣攣、咀嚼或節(jié)律性點(diǎn)頭甩尾;Ⅲ級(jí),頭部顫搐加前肢陣攣性抽搐;Ⅳ級(jí),前肢陣攣、上身直立(袋鼠姿勢(shì))、多肢抽動(dòng)或強(qiáng)直;Ⅴ級(jí),失平衡、跌倒、四肢抽動(dòng);Ⅵ級(jí),全面性強(qiáng)直-陣攣發(fā)作。

1.4.2 RT-PCR 檢測(cè)bcl-2的表達(dá)

將各組大鼠斷頭取腦,迅速分離海馬,使用Trizol提取海馬組織總RNA,測(cè)定其濃度及純度。嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒推薦步驟操作,將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列:bcl-2上游:5’-CTGAACCGGCA TCTGCACAC-3’,下游:5’-GCA GGTCTGCTGACCTCACT-3’,擴(kuò)增長(zhǎng)度195bp;βactin 上游:5’-GAACCCTAA GGCCAACCGTG-3’,下游:5’-TGGCA TA GA GGTCTTTACGG-3’, 擴(kuò) 增 長(zhǎng) 度 為557bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。bcl-2PCR反應(yīng)條件為:94℃2min,94℃45s,56℃45s,72℃45s,32個(gè)循環(huán),72℃延伸5min。取PCR產(chǎn)物5μL行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果進(jìn)行灰度值分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

本研究使用RT-PCR方法比較bcl-2在正常對(duì)照組、癲癇模型組和靈芝孢子粉用藥組的mRNA 的表達(dá)(圖1)。癲癇模型組和靈芝孢子粉用藥組bcl-2的表達(dá)較正常對(duì)照組(0.64±0.05)均降低;其中癲癇模型組(0.54±0.12)bcl-2的表達(dá)水平與對(duì)照組(0.72±0.12)比較明顯降低(P＜ 0.01),靈芝孢子粉用藥組(0.66±0.14)bcl-2的表達(dá)水平與癲癇模型組比較明顯升高 (P＜0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

3 討論

近年研究表明,癲癇發(fā)作可激發(fā)程序性細(xì)胞死亡機(jī)制即細(xì)胞凋亡,并參與腦損傷過(guò)程。凋亡一些研究發(fā)現(xiàn),癲癇發(fā)作會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡,如Pollard等[4]以海人酸(kainic acid,KA)誘導(dǎo)鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE),當(dāng)向鼠杏仁核區(qū)注射KA后,可以觀察到杏仁核區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。喻良等用全蝎醇提物致大鼠SE后發(fā)現(xiàn)誘發(fā)SE后6h,大鼠海馬CA 1、CA 3區(qū)出現(xiàn)TUN EL陽(yáng)性細(xì)胞,并逐漸增多[5]。細(xì)胞凋亡是涉及多基因調(diào)控的復(fù)雜的主動(dòng)死亡過(guò)程,其中bcl-2基因家族在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程中具有重要作用。bcl-2、bax基因是bcl-2基因家族的成員,其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物bcl-2蛋白抑制細(xì)胞的凋亡,而bax蛋白則促進(jìn)凋亡。而bcl-2蛋白可以與bax蛋白結(jié)合形成異二聚體,阻止其轉(zhuǎn)位,bcl-2蛋白還可以控制Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放,抑制鈣超載,還可以阻止自由基產(chǎn)生,抑制細(xì)胞膜上脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成,從而起到抗凋亡的作用。bcl-2水平的增高可抑制細(xì)胞凋亡,但這種自我保護(hù)機(jī)制是有限的,bcl-2可通過(guò)阻止細(xì)胞凋亡的早期環(huán)節(jié)而發(fā)揮作用,可阻止或降低細(xì)胞皺縮,染色質(zhì)濃縮和DNA 裂解的發(fā)生等[6,7]。本研究結(jié)果證實(shí),在PTZ點(diǎn)燃癲癇后,模型組和治療組凋亡抑制基因bcl-2表達(dá)較正常對(duì)照組顯著下降,表明bcl-2基因在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程中起到抑制作用,而給予靈芝孢子粉治療后,bcl-2的表達(dá)與模型組比較顯著增加,提示靈芝孢子粉有效成份能充分作用于腦組織,可以調(diào)控bcl-2的表達(dá),借以發(fā)揮抗凋亡的神經(jīng)保護(hù)作用。

[1]呂艷婷,王淑秋,宋立德.靈芝孢子粉對(duì)戊四氮致癇大鼠大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)PCNA變化的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2010,1(33):37-37

[2]王歡,王淑秋.靈芝孢子粉對(duì)戊四氮致癇大鼠腦組織BDN F表達(dá)的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2006,29(2):5-7

[3]Martina EV,Uta R,PeterM,et al.Pentylenetetrazole(PTZ)-induced c-fos expression in the hippocampusof kindled rats in suppressed by concom itant treatment w ith Naloxone[J].Brain Res,1998,792(3):299-308

[4]Pollard H,Charriant MC,Cantagrel S,et al.1Kainate-induced apoptoic celldeath in hippocampalneurons[J].Neuroscience,1994,63:7-9

[5]喻良,孫紅斌,梁益,等.全蝎醇提物對(duì)Li2Pilo癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2009,26(5):519-522

[6]Kitahara Y,Taga K,Abe H,et al.The effectsof anestheticson cortical spreading depression elicitation and C-fos expression in rats[J].J Neurosurg Anesthesiol,2001,13(1):26

[7]夏永勤,徐如祥,王向宇.亞低溫對(duì)重型顱腦損傷后腦循環(huán)動(dòng)力學(xué)的影響[J].中華創(chuàng)傷雜志,2000,16(10):603

Research of ganoderma lucidum spores on pentylenetetrazol activation Bcl-2 expression of hippocampal neurons

ZHANG Jin-bo,WANG Shu-qiu,ZHANG Hu,ZHANG Shu-hong,ZHANG Yu-ping,LIU Yue-xia
(Basis Medical Science College,Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

Epilepsy is a chronic brain disease characterized by short-term central nervous system disorders due to excessive discharge of brain neurons.Epileptic seizure can cause neuronal death,and cell apoptosis is the main way of neuron death after seizure.One BCL-2 gene fam ilies plays an important role in the regulation of cellapoptosis process.Ganoderma lucidum spores can not only eliminate the free radicals and regulate immune system,but also calm and protect nervous system.The exper iment studies the effect of ganoderma lucidum spores on the expression change of BCL-2 in the hippocampus nerve cells of rats of epilepsy,so as to further explore the relationship between the mechanism of ganoderma lucidum spores(GLS)and controlling gene of apoptosis in the hippocampus nerve cells of Epilepsy.

epilepsy;apoptosis;neuron

R742.1;R285

B

1008-0104(2012)04-0034-01

2012-03-06)

黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目,編號(hào):11553110。

張金波(1974～)女,黑龍江綏濱人,碩士研究生,副教授,研究方向:細(xì)胞凋亡。

王淑秋(1957～)女,黑龍江佳木斯人,碩士研究生導(dǎo)師,教授,研究方向:神經(jīng)免疫內(nèi)分泌。E-mail:wang_shuq@163.com。