尼莫地平對(duì)早期腦出血大鼠AQP4mRNA、MMP-9mRNA表達(dá)的影響

王復(fù)新,張 潔,王 辰,張軍武,侯麗淳,楊 慧

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江佳木斯154003;2.佳木斯市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江佳木斯154002)

尼莫地平對(duì)早期腦出血大鼠AQP4mRNA、MMP-9mRNA表達(dá)的影響

王復(fù)新1,張 潔2,王 辰1,張軍武1,侯麗淳1,楊 慧1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江佳木斯154003;2.佳木斯市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江佳木斯154002)

目的:探討尼莫地平對(duì)早期腦出血周邊組織AQ P4mRNA、MMP-9mRNA表達(dá)及由腦出血引起的繼發(fā)性腦水腫與AQ P4、MMP-9的關(guān)系。方法:制做腦出血大鼠模型,分為假手術(shù)組,腦出血組及尼莫地平組,分別觀(guān)察6h、1d、3d、5d、7d等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)出血周邊腦組織含水量、AQ P4mRNA、MMP-9mRNA。結(jié)果:(1)腦出血組3d含水量達(dá)到高峰,第7天明顯下降,但仍高于正常水平;尼莫地平組3d含水量達(dá)高峰,但低于腦出血組。(2)腦出血組AQ P4mRNA、MMP-9mRNA的表達(dá)逐漸升高,3d達(dá)到高峰,7d明顯下降,5個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯高于假手術(shù)組。(3)尼莫地平組大鼠腦水腫程度、AQ P4mRNA、MMP-9mRNA表達(dá)逐漸升高,3d達(dá)到高峰,明顯低于腦出血組。(4)腦出血的水腫程度與AQ P4mRNA、MMP-9mRNA呈正相關(guān)。結(jié)論:(1)AQ P4、MMP-9參與了出血性腦水腫損傷的過(guò)程。(2)尼莫地平可以抑制AQ P4、MMP-9的表達(dá),進(jìn)而減輕腦水腫的程度。

尼莫地平;早期腦出血;基質(zhì)金屬蛋白酶9

腦出血是神經(jīng)內(nèi)科的常見(jiàn)病之一,而血腫周?chē)M織的腦水腫可以導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高,重者形成腦疝,致死率高。故臨床早期控制腦水腫的進(jìn)展有利于患者的預(yù)后。目前腦水腫的發(fā)生及發(fā)展的病理生理學(xué)機(jī)制并不完全清楚,有多種因素共同參與,其中許多分子機(jī)制參與血腫周?chē)M織水腫的形成及進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)研究以腦出血大鼠為模型,在大鼠腦出血后用PCR法記錄腦組織水通道蛋白4(aquaporin-4,AQ P4)mRNA、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)mRNA的表達(dá),探討它們與腦水腫的關(guān)系,通過(guò)用尼莫地平干預(yù)腦出血大鼠,觀(guān)察AQ P4mRNA、MMP-9mRNA及腦水腫的變化,為臨床早期控制腦水腫提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 腦出血模型的制作和分組

選取雄性健康的Wistar大鼠150只,體重為200～240g,SPF級(jí)。大鼠均在實(shí)驗(yàn)前1w適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境,術(shù)前禁食水12h。假手術(shù)組50只,只進(jìn)針不注血。參考Rosenberg[1]等方法復(fù)制大鼠腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?00只,隨機(jī)分為腦出血組50只,尼莫地平處理組50只。這三組再隨機(jī)分為5個(gè)亞組,為6h、1d、3d、5d、7d等5個(gè)時(shí)間點(diǎn),各10只。尼莫地平組腹腔注射尼莫地平,劑量為每公斤1mg,頻次為Q 8h。

1.2 腦組織含水量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后斷頭取腦,以腦出血點(diǎn)為中心,取其后2mm 腦組織,約140～160mg,先用電子天平稱(chēng)濕重后,后置于96～100℃的烘箱中24h以上,量取干重,根據(jù)公式:腦組織含水量=(濕重一干重)/濕重×l00%,計(jì)算腦組織含水量百分比,表示腦水腫的程度。

1.3 血腫周邊組織AQ P4mRNA、MMP-9mRNA 的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)進(jìn)行,mRNA提取試劑采用Trizol試劑盒,采用寶生物工程公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒。AQ P4mRNA、MMP-9mRNA的結(jié)果利用凝膠圖像分析,行電泳條帶光密度與β-actin產(chǎn)物的光密度的比值作為本實(shí)驗(yàn)AQ P4mRNA、MMP-9mRNA的指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 腦出血周邊組織含水量的動(dòng)態(tài)變化

腦出血組3d含水量達(dá)高峰后逐漸下降,第7天下降明顯,但仍高于假手術(shù)組 (P＜ 0.05)。尼莫地平組給藥后3d含水量達(dá)高峰,各時(shí)間點(diǎn)的含水量均低于腦出血組 (P＜ 0.05)。見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠腦出血周邊組織含水量(±s,%,n=10)

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠腦出血周邊組織含水量(±s,%,n=10)

與假手術(shù)組比較＊P＜ 0.05;與腦出血組比較#P＜ 0.05。

?

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠腦出血周邊組織A PQ 4mRNA(±s,%,n=10)

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠腦出血周邊組織A PQ 4mRNA(±s,%,n=10)

與假手術(shù)組比較＊P＜ 0.05;與腦出血組比較#P＜ 0.05。

?

表3 實(shí)驗(yàn)大鼠腦出血周邊組織MMP-9mRNA(±s,%,n=10)

表3 實(shí)驗(yàn)大鼠腦出血周邊組織MMP-9mRNA(±s,%,n=10)

與假手術(shù)組比較＊P＜ 0.05;與腦出血組比較#P＜ 0.05。

?

2.2 腦出血周邊組織A PQ 4mRNA的動(dòng)態(tài)變化

出血組6hAQ P4mRNA較假手術(shù)組表達(dá)增加,隨著出血時(shí)間延長(zhǎng),AQ P4表達(dá)逐漸增強(qiáng),3d達(dá)高峰,7d逐漸下降(P＜0.05),尼莫地平組各時(shí)間點(diǎn)AQ P4mRNA較出血組降低 (P＜ 0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 腦出血周邊組織MMP-9mRNA的動(dòng)態(tài)變化

腦出血組6h較假手術(shù)組即明顯表達(dá)MMP-9mRNA,3d達(dá)高峰,各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量與假手術(shù)組比較均有顯著差異(P＜0.05),尼莫地平組給藥后各時(shí)間點(diǎn)AQ P4表達(dá)明顯降低 (P＜ 0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 相關(guān)分析

腦出血組大鼠AQ P4mRNA、MMP-9mRNA的表達(dá)與腦含水量的變化規(guī)律趨于一致(r= 0.714;0.726,P＜ 0.01)。

3 討論

水通道蛋白是一種位于細(xì)胞膜上的內(nèi)在膜蛋白,目前發(fā)現(xiàn)有13種水通道蛋白,其中AQ P4主要位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。AQ P4主要功能為調(diào)節(jié)水鹽代謝,進(jìn)而影響到細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓[2]。近年來(lái),在腦組織水腫中AQ P4所發(fā)揮的作用已受到有關(guān)專(zhuān)家和學(xué)者的注意。文獻(xiàn)也報(bào)道[3],腦組織中AQ P4的表達(dá)與腦水腫程度呈正相關(guān)。在腦水腫的形成和進(jìn)展的過(guò)程中,AQ P4發(fā)揮著重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一個(gè)大的蛋白家族,需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子可以降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分。MMP-9是被糖化的Ⅳ型膠原酶,可以降解Ⅳ型膠原,引起毛細(xì)血管的損傷,抑制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的通路,導(dǎo)致基底膜破裂,血腦屏障被破壞[4]。MMP-9在腦組織缺血、缺氧和應(yīng)激情況下釋放增加。在基因轉(zhuǎn)錄的水平上,血小板源生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素1等生長(zhǎng)因子可以誘導(dǎo)MMP-9增加;Nordqvist研究表明MMP-9與腦卒中后血管源性腦水腫的關(guān)系密切[5]。出血性腦水腫的機(jī)制可能血漿蛋白以及凝血酶釋放的物質(zhì)等積聚使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變[6],激活位于血腦屏障基膜上的AQ P4,致使K+外流增多,Na+內(nèi)流增加,導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化、鈣離子通道開(kāi)放,大量Ca2+進(jìn)入細(xì)胞,又會(huì)促進(jìn)AQ P4的過(guò)度表達(dá),使血腦屏障通透性增加導(dǎo)致腦水腫[7]。MMP-9降解細(xì)胞外基質(zhì)會(huì)導(dǎo)致血腦屏障的破壞、炎癥反應(yīng)的擴(kuò)散和巨噬細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附等病理過(guò)程,加重腦水腫的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中腦出血組6 h AQ P4mRNA、MMP-9mRNA明顯高于正常水平,3d達(dá)到峰值,7d仍比正常組高,腦出血后AQ P4、MMP-9的過(guò)度表達(dá)與腦水腫的發(fā)展有密切關(guān)系。尼莫地平是二氫吡啶類(lèi)鈣拮抗劑,作用于二氫吡啶類(lèi)電壓依賴(lài)性鈣通道受體,致使鈣通道受體構(gòu)型發(fā)生變化,從而阻斷Ca2+內(nèi)流,降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,提示尼莫地平有可能是通過(guò)阻斷Ca2+內(nèi)流,來(lái)降低AQ P4、MMP-9的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中尼莫地平組較腦出血組腦含水量明顯減少,AQ P4、MMP-9的表達(dá)明顯低于腦出血組?？赡芘c尼莫地平通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞分泌炎癥因子,進(jìn)而間接地控制了MMP-9的表達(dá)。AQ P4、MMP-9與Ca2+關(guān)系的具體分子機(jī)制目前還不明確,有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。本研究結(jié)果表明MMP-9、AQ P4參與了出血性腦水腫的病理過(guò)程,尼莫地平可以抑制AQ P4、MMP-9的表達(dá),進(jìn)而減輕腦水腫的程度,為早期臨床治療出血性腦水腫提供了新的靶點(diǎn)。

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Effects of nimodipine on the expression of AQP4 andMMP-9 in early cerebral hemorrhage rats

WANG Fu-xin1,ZHANG Jie2,WANG Chen1,ZHANG Jun-wu1,HOU Li-chun1,YANG Hui1
(1.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China;2.Department of Neurology,JiamusiCentralHospital,Jiamusi 154002,China)

Objective:To discuss the expression of nimodipine on AQ P4 andMMP-9mRNA in early cerebral hemorrhage surrounding tissue and the relationship of secondary brain edema caused by cerebral hemorrhage and AQ P4、MMP-9.Methods:Cerebral hemorrhagemodelof ratswere divided into control group,cerebral hemorrhage group and n imodipine group.The water content of brain,AQP and MMP-9 mRNA were observed on 6h,1d,3d,5d,7d after intracerebral hemorrhage.Results:(1)On 3din the ICH group,the brain water content peaked and on 7dit decreased but still higher than normal.On 3din the nimodipine group,the brain water content peaked but still lower than ICH group.(2)AQ P4 and MMP-9 of cerebral hemorrhage group was higher than that of control group at five points,whose expression gradually increased,peaked on 3d,obviously decreased on 7d.(3)Rat’sBrain edema degree and expression of AQ P4 andMMP-9 in nimodipine group were less than those in cerebral hemorrhage group,whose expression gradually increased,peaked on 3d.(4)The degree of intracerebral hemorrhage edema and AQ P4 andMMP-9mRNA were positively correlated.Conclusion:(1)MMP-9 and AQ P4 involved in the process of hemorrhagic brain edema damage.(2)Nimodipine can inhibit the expression of AQ P4 andMMP-9 so as to reduce the degree of brain edema.

n imodipine;cerebral hemorrhage rats;matrixmetalloproteinase-9

R743.34

B

1008-0104(2012)04-0001-02

2012-04-15)

王復(fù)新(1956～)男,黑龍江佳木斯人,教授,碩士,碩士研究生導(dǎo)師,從事腦血管病發(fā)病機(jī)理與臨床的研究。