肝癌胃癌組織中端粒酶活性的檢測及其與癌組織病理類型關(guān)系的研究

延長油田股份有限公司青化砭采油廠衛(wèi)生所（延安716000） 楊東梅

端粒酶（Telomerase）是一種核糖核蛋白酶，能以自身RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA，以維持端粒的一定長度，端粒的一定長度是維持細(xì)胞正常分裂及其壽命所必需的［1］。正常機體細(xì)胞除生殖細(xì)胞和干細(xì)胞外，均測不到端粒酶活性。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，多種人類惡性腫瘤組織端粒酶活性顯著升高，端粒酶活化與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1］。本文用端粒酶PCR－ELISA法對不同病理類型的肝癌和胃癌組織標(biāo)本進(jìn)行了端粒酶活性檢測與研究，旨在探討端粒酶在肝癌和胃癌組織中的表達(dá)情況及其與腫瘤病理類型的關(guān)系，并為肝癌和胃癌診斷提供一種分子標(biāo)記物。

材料與方法

1 肝癌和胃癌標(biāo)本分型與處理 肝癌標(biāo)本分為四型：塊狀型（單個或多個融合癌塊直徑＞5cm）；結(jié)節(jié)型（癌結(jié)節(jié)數(shù)目不等，直徑介于3～5cm）；小肝癌（孤立的直徑＜3cm的癌結(jié)節(jié)，或相鄰兩個癌結(jié)節(jié)直徑之和＜3cm）；彌散型（癌組織呈彌散分布無明顯結(jié)節(jié)或呈米粒至黃豆大小49篇結(jié)節(jié)散布于全肝）。胃癌標(biāo)本分為五型：乳頭狀腺癌，管狀腺癌，低分化腺癌，印戒細(xì)胞癌，未分化癌。所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診。標(biāo)本采集后立即置于液氮中，然后移到－80℃低溫冰箱中保存。端粒酶提取與檢測的全套試劑為德國Boehringer Manheim公司產(chǎn)品。

2 端粒酶提取與活性檢測 用端粒酶PCRELISA法對肝癌和胃癌標(biāo)本及非癌肝胃組織標(biāo)本進(jìn)行端粒酶活性檢測。操作方法簡述如下：各組織標(biāo)本50mg在200μl預(yù)冷的裂解液中勻漿化，置碎冰中作用30min，在4℃下20000r／min離心20min，取上清液保存于－80℃?zhèn)溆?。每份樣品?5μl反應(yīng)混合液，加入2μl細(xì)胞提取液（30μg蛋白／ml）。再加人無菌雙蒸水50μl，在DNA熱循環(huán)儀上進(jìn)行引物延伸與DNA擴增。陰性對照以每5μl細(xì)胞提取液加人1μg／μl無DNA酶的RNA酶，37℃孵育20min后，再做PCRELISA。實驗參數(shù)如下：引物延伸，25℃20mim；端粒酶滅活，94℃5mim；擴增條件為：變性94℃30s，復(fù)性50℃30s，延伸72℃90s，共30個循環(huán)，再加入5μl擴增產(chǎn)物，在室溫下孵育10mim，再加入225μl雜交液（含DIG標(biāo)記的探針）混勻。取上述混合液，每孔100μl加人用親和素預(yù)包被的微量反應(yīng)板。300r／min搖床37℃培養(yǎng)2h。甩凈雜交液，250μ1洗液每次30s洗3次，甩干。每孔加入抗 DIG－POD 100μl，再在37℃下300r／min搖床培養(yǎng)30min，甩凈孔內(nèi)液體，加入100μl TMB液（含DIG底物），在室溫下顯色l5 min。每孔加入100μl終止液，用DG5031型酶標(biāo)分析儀以450m波長測量吸光值（A）。樣品A值／陽性對照A值＞2．0為陽性。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 用χ2檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。χ2值用Person的檢驗公式計算，α值定為0．05。

結(jié) 果

各種病理類型肝癌組織端粒酶活性總陽性率為89．4% （42／47），明 顯 高 于 非 癌 肝 組 織 （0／10，0．00%），二者比較具有高顯著性差異（P＜0．01）。各種病理類型胃癌組織端粒酶活性總陽性率為85．0%（51／60），明顯高于非癌胃組織（1／20，5．00%），二者比較具有高顯著性差異（P＜0．01）。

表1 不同類型的肝癌組織與正常組織端粒酶活性陽性率

表2 不同病理類型的胃癌組織與正常組織端粒酶活性陽性率

討 論

端粒（Telomere）是真核細(xì)胞染色體的末端結(jié)構(gòu)，由DNA和端粒結(jié)合蛋白組成。端粒DNA由短的堿基序列多次重復(fù)組成，人類端粒DNA由TTAGGG序列重復(fù)約2000次而成。端粒具有穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞正常壽命或決定細(xì)胞分裂次數(shù)等功能。1972年，諾貝爾獎獲得者Watson提出了真核細(xì)胞必有一種機制來防止其端粒DNA隨細(xì)胞分裂而不斷丟失的問題，紐約冷泉巷分子生物學(xué)研究室的人員隨即開始了這方面的研究，并于1978年搞清了四膜蟲端粒DNA的一級結(jié)構(gòu)，于1985年在四膜蟲細(xì)胞提取液中發(fā)現(xiàn)了端粒酶［2］。端粒酶是一種具有逆轉(zhuǎn)錄功能的核糖蛋白酶，能以自身RNA為模板，以染色體3’末端DNA為引物延伸端粒DNA。該酶的發(fā)現(xiàn)，使Watson提出的問題得到了解答。1989年，Morin在來自人類惡性腫瘤的傳代細(xì)胞系－－HeLa細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了端粒酶活性；繼之，Counter等又在腹水轉(zhuǎn)移的卵巢癌中檢測到了端粒酶活性，引起了人們對端粒酶與細(xì)胞永生化和腫瘤發(fā)生關(guān)系的注意［3］。1994年，Kim等建立了檢測端粒酶活性的TRAP法。TRAP法及由其衍生出的端粒酶PCR－ELISA法，具有高度敏感（可從只有10個細(xì)胞的標(biāo)本中測出端粒酶活性），高度特異，和比較快速與簡便等優(yōu)點。近年來國內(nèi)外的諸多研究發(fā)現(xiàn)，正常機體除生殖細(xì)胞及造血干細(xì)胞外，大多數(shù)細(xì)胞沒有端粒酶活性，但端粒酶在約90%以上的惡性腫瘤中呈陽性，其活性的表達(dá)被認(rèn)為是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的一個關(guān)鍵事件，是惡性腫瘤細(xì)胞得以無限增殖的必需條件［4～7］。

胃癌和肝癌是我國最常見的惡性腫瘤，分別為我國人口惡性腫瘤死亡原因之第2位和第3位，僅次于肺癌。眾多研究表明，胃癌組織的端粒酶活性陽性率在76%～94%［8］；肝癌組織的端粒酶活性陽性率在80%～100%［9］。本文用PCR－ELISA法，對各種病理類型的肝癌和胃癌組織及非癌肝胃組織標(biāo)本進(jìn)行了端粒酶活性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各種病理類型肝癌組織端粒酶活性總陽性率為89．4%，顯著性地高于非癌肝組織；各種病理類型胃癌組織端粒酶活性總陽性率為85．0%，顯著性地高于非癌胃組織。而不同類型肝癌組織的端粒酶陽性率之間和不同類型胃癌組織的端粒酶陽性率之間無顯著性差異。因此，端粒酶活性檢測不能用于肝癌和胃癌病理類型之區(qū)別，但可作為一種分子標(biāo)記物而用于肝癌與胃癌的輔助診斷，亦可用于肝癌與胃癌和各種非癌性病變的鑒別診斷。

考參文獻(xiàn)

［1］ 鄧守恒，曾小華，曹鳳軍，等．硒化殼聚糖對NB4細(xì)胞增殖的影響及其與端?；钚院蚳TERT基因表達(dá)的關(guān)系［J］．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2010，39（3）：282－284．

［2］ 符兆英，劉曉斌，陳延偉．端粒酶與腫瘤關(guān)系研究進(jìn)展［J］．中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2001，11（7）：34－36．

［3］ 符兆英，Matthews James．肝腫瘤與正常肝組織端粒酶活性檢測［J］．陜西醫(yī)學(xué)雜志，1999，28（4）：233－235．

［4］ 肖 冰，李建利，楊彥玲．胃癌組織端粒酶活性的表達(dá)及其臨床意義［J］．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2008，37（11）：1523－1525．

［5］ Zhou Xi，Zhang Peng Hui．Stable inhibition of hTERT gene by siRNA in hepatocarcinoma cells ［J］．J Fourth Mil Med Univ，2005，26（24）：2233－2236．

［6］ Jaskelioff M，Muller FL，Paik JH，et al．Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase－deficient mice［J］．Nature，2011，469（7328）：102－106．

［7］ Lu Y，Gu J，Jin D，Gao Y，et al．Inhibition of telomerase activity by HDV ribozyme in cancers［J］．J Exp Clin Cancer Res，2011，30：1．

［8］ 高 楓，符兆英．特異性環(huán)氧合酶－2抑制劑SC236誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株凋亡的實驗研究［J］．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009，17（8）：1423－1425．

［9］ 黃光琳．肝癌血清標(biāo)志物研究進(jìn)展［J］．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2010，39（12）：1681－1682．