中華大蟾蜍抗菌肽對癌細(xì)胞的生長抑制作用

[摘要] 目的 篩選中華大蟾蜍抗腫瘤活性物質(zhì)，檢測其抗腫瘤活性。方法 本實(shí)驗(yàn)通過凝膠過濾層析及高效液相色譜法，從皮膚分泌物中分離出具有抗細(xì)菌、抗腫瘤活性的物質(zhì)，即中華大蟾蜍抗菌肽。以大腸癌細(xì)胞為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停ㄟ^細(xì)胞形態(tài)學(xué)、MTT實(shí)驗(yàn)，研究中華大蟾蜍抗菌肽對SW480細(xì)胞的殺傷和生長抑制作用。結(jié)果 經(jīng)過分離純化得到較純的活性物質(zhì)，即中國大蟾蜍抗菌肽。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察到中華大蟾蜍抗菌肽作用組中細(xì)胞的數(shù)量明顯的減少，細(xì)胞明顯皺縮，成圓形，死細(xì)胞增多。MTT實(shí)驗(yàn)表明，中華大蟾蜍抗菌肽對SW480的生長抑制作用隨著濃度的增加而加強(qiáng)。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)成功篩選到中華大蟾蜍抗菌肽，并檢測其在體外對SW480具有抑制生長作用。

[關(guān)鍵詞] 中華大蟾蜍；抗菌肽；生長抑制

[中圖分類號] R73-34 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2011）36-24-03

Growth Inhibiting Effect of Antibacterial Peptides in Bufo Gargarizans on Cancer Cells

CHEN Liping HE Lili BA Yunfei

Department of Neurology，the People's Hospital of Dehui City in Jilin Province，Dehui 130300，China

[Abstract] Objective To screen the Bufo bufo gargarizans cantor active materials，and test its antitumor activity. Methods The Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides was separated and purified by gel filtration chromatography and HPLC. The colorectal cancer SW480 was used as the model in vitro. The cell morphology and MTT were accepted to study the lethal effect and growth inhibiting of Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides to SW480. Results It indicated that a species of Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides was got through gel filtration chromatography and HPLC. The number of cells reduced，and the shap of the cells become shrinkage round significantly treated by Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides. The more Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides added，the more lethal effect and growth inhibiting effection was showed up by MTT. Conclusion The experiment is successful in screening Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides，and testing the role of inhibition of growth to SW480 in vitro.

[Key words] Bufo bufo gargarizans cantor；Antimicrobial peptide；Growth inhibiting

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是生物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類抵抗外界病原體感染的多肽，廣泛存在于昆蟲、植物、動(dòng)物及人體內(nèi)?？咕氖且环N小肽，分子量一般小于10kDa，僅僅包含12～50個(gè)氨基酸，由基因編碼、核糖體合成[1-3]。抗菌肽一般可以形成α-螺旋和β-折疊，抗菌肽的α-螺旋結(jié)構(gòu)具有完美的水脂兩親性[4]，此結(jié)構(gòu)是決定抗菌肽抗菌活性的基礎(chǔ)。它除有非特異性的抗細(xì)菌、真菌、病毒等病原體外，還有抗腫瘤細(xì)胞的作用，特別是對多重耐藥菌和腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，而不破壞人體的正常細(xì)胞，是一類具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕?，是目前抗病原微生物藥物開發(fā)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。1980年，Boman等科學(xué)家在惜古比天蠶蛹的體內(nèi)純化到一種被稱為cecropin[5]的昆蟲抗菌肽，1987年，從光滑爪蟾的皮膚中分離純化得到magainin蛙皮抗菌肽。迄今為止，研究者已從兩棲類動(dòng)物皮膚中篩選到1000余種抗菌肽[6]，而以天然抗菌肽作模板進(jìn)行人工合成的模擬肽已達(dá)數(shù)千種。

本實(shí)驗(yàn)通過對中華大蟾蜍進(jìn)行乙醚刺激，生理鹽水收集其皮膚分泌物，利用凝膠過濾層析及反向高效液相色譜兩種方法，分離純化皮膚分泌物中的抗細(xì)菌、抗腫瘤活性物質(zhì)，并對其抗細(xì)菌、抗腫瘤活性進(jìn)行初步活性檢測，以期篩選出新的抗細(xì)菌、抗腫瘤藥物，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞及菌種 中華大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans cantor）兩棲綱（Aves）、無尾目、蟾蜍科、蟾蜍屬族，本試驗(yàn)材料購自市場。大腸埃希氏桿菌E.coli ATCC25922、金黃色葡萄球菌S.aureus ATCC25923均由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸癌細(xì)胞SW480由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院饋贈。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 凝膠過濾柱（長100cm，直徑25mm）、高速離心機(jī)（Eppendorf）、真空冷凍干燥機(jī)（FD-1-50）、KTA explorer100（GE）、制備型反相高效液相色譜LC-8A（島津）、C18半制備柱（ACE）、超純水機(jī)（ROP-100）和自動(dòng)板式酶標(biāo)儀ZS-2。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 SephadexG-25填料購自GE公司；Na2HPO4-

NaH2PO4，pH6.0；三氟乙酸（Sigma，HPLC級）；乙腈（Merck，HPLC級）；超純水（含0.1％TFA）；乙腈（含0.1％TFA）；MTT，DMSO均購自Sigma公司；MEM培養(yǎng)基、MH固體培養(yǎng)基均購自于TaKaRa公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中華大蟾蜍皮膚分泌物的收集 活體中華大蟾蜍30只，用超純水充分沖洗皮膚，放入密閉容器中，乙醚刺激2～3min，中華大蟾蜍皮膚表面可見泡沫狀物質(zhì)從皮膚分泌出來，立刻用生理鹽水沖洗，收集沖洗液，12000r/min離心20min，0.22μm濾膜過濾，冷凍干燥后，放入-40℃低溫保存。

1.2.2 凝膠過濾層析半純化抗菌肽 將SephadexG25柱裝好后，用超純水以1.0mL/min的流速沖洗2～3倍柱體積。再用流動(dòng)相（Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0）以3.0mL/min的流速平衡2～3倍柱體積。在215nm、280nm波長下監(jiān)測，上樣及洗脫在SephalexG25色譜柱平衡后，加樣品溶液1～2mL，用流動(dòng)相溶液以3.0mL/min的流速進(jìn)行洗脫，將每個(gè)峰分別收集，以S.aureusATCC25923作為實(shí)驗(yàn)樣品檢測的指示菌，藥敏片法檢測各收集峰的抑菌效果。

1.2.3 制備型反相高效液相色譜純化抗菌肽 樣品經(jīng)凝聚過濾層析后，收集具有抗菌活性的物質(zhì)并將其真空冷凍干燥，然后溶于含0.1%三氟乙酸水溶液中，然后用10000轉(zhuǎn)離心5min，吸取上清液棄沉淀，接著把上清液過0.22μm的濾膜。A液為含0.1％三氟乙酸的超純水，B液為含0.1％三氟乙酸的乙腈。流速設(shè)置為2mL/min，每次上樣2mL，根據(jù)色譜曲線中的色譜峰，分步收集各峰的樣品，并記錄時(shí)間，以S.aureus ATCC25923作為實(shí)驗(yàn)樣品檢測指示菌，檢測各峰的抑菌活性，將具有抗菌活性物質(zhì)即中國大蟾蜍抗菌肽真空冷凍濃縮。

1.2.4 癌細(xì)胞殺傷作用 將大腸癌細(xì)胞SW480用DMEM培養(yǎng)基加上10%胎牛血清培養(yǎng)在96孔板中，濃度為5×105cell/孔，終體積為100μL，過夜培養(yǎng)12h。我們將抗菌肽樣品經(jīng)過0.45μm濾器過濾，并將其濃度稀釋為0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL，作用于SW480細(xì)胞（抗菌肽組），24h顯微鏡觀察結(jié)果，與空白對照組對比癌細(xì)胞變化情況。

1.2.5 對SW480細(xì)胞的生長抑制作用 多肽對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用是用MTT-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）2，5-diphenyl tetrazolium romide測定的[7-10]。我們將大腸癌細(xì)胞SW480用DMEM培養(yǎng)基加上10%胎牛血清培養(yǎng)在96孔板中，濃度為5×103cell/孔，終體積為100μL，貼壁培養(yǎng)24h，培養(yǎng)條件溫度37℃，5%的CO2，濕度95%。把中華大蟾蜍抗菌肽用PBS充分溶解，不同濃度的多肽與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)24h（多肽在96孔板中最終濃度為0μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，60μg/mL，80μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL），并且每個(gè)濃度要有三個(gè)平行孔。吸掉培養(yǎng)液，然后加入100μL的DMEM培養(yǎng)基和20μL的MTT（濃度為5mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后吸掉上層培養(yǎng)液后加入150μL的DMSO后，震蕩10min后，用酶標(biāo)儀在570nm下測量其吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 分離純化結(jié)果

皮膚分泌物的粗提物經(jīng)過凝膠過濾層析純化后，以280nm為監(jiān)測波長，收集各峰，并以S.aureusATCC25923作為實(shí)驗(yàn)樣品的指示菌，藥敏片法檢測抑菌活性峰，確定其中4號峰為活性峰。利用制備型反向高效液相色譜，C18反相色譜柱繼續(xù)對凝膠過濾層析活性峰作進(jìn)一步的分離，以215nm作為監(jiān)測波長，收集各峰，同樣以S.aureusATCC25923作為實(shí)驗(yàn)樣品的指示菌測定各收集峰的抑菌活性，最終獲得中華大蟾蜍抗菌肽。圖1為粗提物凝膠過濾層析及高效液相色譜分離圖；圖2為凝膠過濾層析（左）、高效液相色譜（右）活性峰的抑菌結(jié)果。

2.2 對SW480殺傷作用

將中華大蟾蜍抗菌肽作用于大腸癌細(xì)胞SW480，倒置顯微鏡下觀察，對照組的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，而在抗菌肽組中，當(dāng)抗菌肽濃度達(dá)到0.1mg/mL時(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化，細(xì)胞變小、變圓，折光率變大，細(xì)胞整體明顯皺縮，邊緣不光滑，細(xì)胞間隙明顯增大，漂浮的死細(xì)胞增多，且伴有細(xì)胞碎片的懸浮。當(dāng)抗菌肽濃度達(dá)到0.3mg/mL、0.5mg/mL時(shí)，看不到細(xì)胞存在（圖3）。

2.3 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同濃度抗菌肽組作用于大腸癌細(xì)胞48小時(shí)后，其抑制率曲線如圖4所示。中華大蟾蜍抗菌肽對大腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞有生長抑制作用呈現(xiàn)量-效關(guān)系。當(dāng)中國大蟾蜍抗菌肽的濃度達(dá)到60μg/mL大腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞開始有抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到200μg/mL時(shí)抑制率幅度增長緩慢，在濃度（10～40）μg/mL時(shí)并沒有變現(xiàn)出抑制作用。

3 討論

兩棲動(dòng)物抗菌肽的抗癌作用機(jī)理比較復(fù)雜[11]，目前主要以細(xì)胞骨架損傷學(xué)說為主，認(rèn)為抗菌肽對正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均具有損傷作用，但由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞骨架完整，且修復(fù)快，故抗菌肽對其不造成最終損傷，而腫瘤細(xì)胞骨架不完整，當(dāng)被抗菌肽作用以后，得不到及時(shí)有效的修復(fù)而導(dǎo)致最終損傷。還有研究者認(rèn)為抗菌肽可以從細(xì)胞膜、線粒體、核膜、細(xì)胞核染色體DNA、溶酶體等幾個(gè)方面影響癌細(xì)胞的生存[12]，且能調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)，抵抗癌瘤的侵襲，這主要是從體液方面來實(shí)現(xiàn)。Jaynes等報(bào)道以CecropinB為藍(lán)本，合成一種新型的抗菌肽，不僅對細(xì)菌、真菌和原蟲有較強(qiáng)的穿透作用，而且對腫瘤細(xì)胞有明顯的殺傷作用；Chen JY等[13]還證實(shí)抗菌肽Epinecidin-1抑制人白血病細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；趙瑞君等[14]報(bào)道家蠅成蟲抗菌肽對腫瘤細(xì)胞109、K562、Daudi及T24的有效殺傷力都在85%以上，

本實(shí)驗(yàn)通過對中華大蟾蜍乙醚刺激獲得皮膚分泌物，利用分離凝膠過濾層析和反向高校液相色譜層析兩種分離純化方法，獲得中華大蟾蜍抗菌肽。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中華大抗菌肽除了具有抗菌效果，而且對大腸癌細(xì)胞SW480同樣具有很好的抑制作用。我們利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)的方法，在倒置顯微鏡觀察到細(xì)胞的一些變化，當(dāng)抗菌肽濃度達(dá)到0.1mg/mL時(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化，細(xì)胞貼壁性下降，細(xì)胞變小，邊緣不光滑，細(xì)胞間隙明顯增大，當(dāng)抗菌肽濃度達(dá)增大到0.3mg/mL和0.5mg/mL時(shí)，只能觀察到細(xì)胞碎片的存在。我們還利用MTT法研究中華大蟾蜍抗菌肽對大腸癌細(xì)胞SW480生長抑制作用，結(jié)果顯示，抗菌肽濃度在（60～200）μg/mL時(shí)，中華大蟾蜍抗菌肽對SW480細(xì)胞抑制率成量-效關(guān)系，而當(dāng)抗菌肽達(dá)到200μg/μL以上的濃度時(shí)，對癌細(xì)胞的抑制率增長比較緩慢。

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（收稿日期：2011-10-28）