外源性磷酸肌酸鈉對肢體缺血再灌注的保護作用

[摘要] 目的 探討外源性磷酸肌酸鈉（CP）對缺血再灌注肢體的保護作用。 方法 健康成年家兔20只，隨機分為對照組、缺血再灌注組（IR）、低濃度磷酸肌酸鈉組（LCP)和高濃度磷酸肌酸鈉組（HCP），每組5只。制備兔左后肢缺血再灌注模型。靜脈注射生理鹽水和不同濃度的CP，再灌注前、后不同時間取血測定血清乳酸脫氫酶(LDH)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。電鏡觀察肌細胞超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果 缺血再灌注后LCP和HCP組LDH、AST、MDA含量低于IR（P＜0.05），SOD活力顯著高于IR（P＜0.01）；電鏡下LCP和HCP組肌損傷輕于IR組。 結(jié)論 外源性磷酸肌酸鈉能夠保護缺血再灌注骨骼肌。

[關(guān)鍵詞] 外源性磷酸肌酸鈉；兔；骨骼肌；再灌注損傷

[中圖分類號] R541 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2011）36-08-02

Protective Effects of Creatine Phosphate on Ischemia and Reperfusion Injury of Limbs

LIU Mingming1 DING Ming2

1.The Anesthesiology of Weifang Medical College，Weifang 261041， China； 2.The Anesthesia Department of the 89th Chinese People's Liberation Army Hospital，Weifang 261023，China

[Abstract] Objective To study the protective effect of creatine phosphate on ischemia reperfusion of skeletal muscle. Methods The experimental models of ischemia referfusion injury in extremities were produced in 20 healthy adult rabbits，which were randomly divided into control，reperfusion，low concentration and high concentration with 5 rabbits in each .Isolated left hindlimb of rabbits were used as ischemia-reperfusion models.Normal saline injection， Creatine phosphate 0.5g and 1g were infused intravenously into the three groups just before blood reperfusion. At the points of pre-ischemia，1 and 4 hours after reperfusion，the blood samples were collected respectively for measurements of LDH，AST， MDA and SOD. Meanwhile，the tibialis anterior muscles were harvested for examination of the micro-structure and the ultrastructure by using electron microscope. Results After reperfusion，the contents of AST，LDH，MDA significantly decreased（P＜0.05）and the activity of SOD obviously increased in the HCP and LCP groups compared with reperfusion group（P＜0.01）. The electron microscope examinations showed severe tissue injury in the reperfusion group but mild in HCP and LCP groups. Conclusion Creatine phosphate has a significant protective effect on ischemia reperfusion injury in extremities.

[Key words] Creatine phosphate ；Rabbit； Skeletal muscle；Reperfusion injury

臨床上常見的斷肢(指)再植、軟組織損傷、骨筋膜室綜合征、血栓形成及應(yīng)用止血帶時間過長等，均會引起肢體缺血-再灌注（Ischemia-reperfusion， I-R）損傷[1]。磷酸肌酸鈉作為一種外源性的能量合劑，對缺血再灌注心肌具有確切保護作用[2]。但外源性磷酸肌酸鈉對骨骼肌缺血再灌注損傷的影響尚未見報道。本實驗制備家兔肢體缺血再灌注損傷模型，探討外源性磷酸肌酸鈉對肢體缺血再灌注骨骼肌的作用。

1 材料與方法

1.1動物分組與模型建立

健康成年家兔20只，體重2.5～3.5kg，雌雄不限，解放軍第89醫(yī)院動物中心提供。隨機分為對照組、IR、LCP和HCP，每組5只。

1.2 建立家兔后肢缺血再灌注損傷動物模型

3%戊巴比妥鈉30mg/kg靜脈麻醉，參照Crinnion[3]法建立家兔后肢骨骼肌缺血再灌注損傷模型。①對照組：只解剖出股動靜脈，不阻斷不環(huán)扎。②缺血組：恢復(fù)血流前耳緣靜脈給予生理鹽水1mL，再灌注4h。③低濃度組：恢復(fù)血流前給予外源性磷酸肌酸鈉溶液（北京利祥制藥有限公司生產(chǎn)，0.5mg，生產(chǎn)批號100602）0.5g/mL 1mL，再灌注4h。④高濃度組：恢復(fù)血流灌注前給予外源性磷酸肌酸鈉1g/mL 1mL，再灌注4h。

1.3檢測項目及方法

四組分別于缺血前、缺血再灌注1h、再灌注4h，3個時相點采血并制備電鏡標(biāo)本。

1.3.1生化指標(biāo)檢測 AST、LDH的測定采用羅氏P800全自動生化分析儀。MDA和SOD測定采用硫代巴比妥鈉法和黃嘌呤氧化酶法，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.3.2電鏡觀察 將取得的骨骼肌標(biāo)本切成1mm×1mm×1mm大小的組織塊，經(jīng)30g/L戊二醛4℃前固定2h，再經(jīng)鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，鉛鈾雙重染色，透射電鏡觀察并攝片。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）表示。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，多組樣本均數(shù)間先進行方差齊性檢驗，不同組間同一時間比較采用單因素方差分析，當(dāng)差異明顯時進一步比較采用LSD檢驗，方差不齊則采用Dunnet’s T3法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)檢測結(jié)果

缺血組再灌注后1h、4h，IR組較對照組AST、LDH、MDA含量明顯升高（P＜0.01），SOD的活力明顯下降（P＜0.01）；缺血再灌注后1h和4h，HCP和LCP組AST、LDH、MDA含量較IR組降低（P＜0.05），SOD的活力明顯增高（P＜0.01）。見表1。

2.2 電鏡結(jié)果

再灌注后4h，IR組顯示線粒體呈明顯空泡樣變，可見明顯髓樣變，線粒體嵴斷裂、消失。LCP組仍可見相當(dāng)正常結(jié)構(gòu)肌組織，但線粒體部分呈空泡樣變、髓樣變，部分線粒體嵴斷裂。HCP組肌組織基本完整，線粒體未見明顯損傷變性。

3討論

肢體缺血再灌注損傷指肢體缺血達到一定時間，在恢復(fù)血供后反而出現(xiàn)比缺血時更加嚴(yán)重的損傷，表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)與功能損害的進一步加重。缺血再灌注損傷是個多機制參與的損傷過程，能量代謝障礙、鈣離子超載、氧自由基、白細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)等在骨骼肌缺血再灌注損傷中起關(guān)鍵作用[4]。

正常肌細胞內(nèi)含豐富的AST、LDH，肌細胞受損后酶可釋放入血，其含量高低可反映細胞損傷的程度。SOD可有效清除氧自由基，反映機體抗氧化能力； MDA是脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量可間接反映氧自由基對機體造成的損傷程度。SOD和MDA是反映氧化損傷的指標(biāo)[5]。

線粒體在缺血再灌注損傷發(fā)生及其發(fā)展中決定細胞存亡的關(guān)鍵[6]。CP可以抑制5’-核苷酸酶的活性，使溶血磷脂酸甘油脂濃度下降，穩(wěn)定磷脂膜。CP維持呼吸鏈正常氧化磷脂化功能保證ATP高水平，使氧自由基生產(chǎn)減少，保護機體免受氧自由基損傷[7，8]。

本次實驗顯示，缺血再灌注后IR組AST、LDH、MDA含量較對照組明顯升高（P＜0.05），SOD活力較對照組明顯降低（P＜0.01），說明IR組骨骼肌在缺血再灌注后發(fā)生了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，細胞膜損傷嚴(yán)重。LCP組和HCP組缺血再灌注后AST、LDH、MDA含量較IR組降低（P＜0.05），SOD活力升高顯著（P＜0.01）。經(jīng)電鏡形態(tài)學(xué)觀察證實在缺血再灌注4h后IR組細胞損傷明顯，LCP組細胞損傷較IR組減輕，HCP組幾乎接近正常組織細胞。本實驗說明應(yīng)用外源性磷酸肌酸鈉能減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，組織清除自由基能力增強，減輕線粒體的損傷，對肢體缺血再灌注損傷有顯著的保護作用。本研究為外源性磷酸肌酸鈉在肢體缺血再灌注損傷保護方面，提供了一定的實驗依據(jù)，但最佳保護劑量還有待進一步探索。

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（收稿日期：2011-10-19）