廣州市人感染H7N9禽流感病毒高致病性變異株監(jiān)測(cè)與基因進(jìn)化分析

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禽流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒，根據(jù)病毒粒子表面抗原血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同，分為不同亞型：H1～H16，N1～N9[1-2]。禽流感病毒通常感染禽類，引起動(dòng)物隱性感染、發(fā)病或死亡。我國(guó)自1997年開始，先后出現(xiàn)了H5N1、H9N2、H5N6、H6N1、H7N9、H10N8等人禽流感病毒感染病例[3-5]，對(duì)我國(guó)的公共衛(wèi)生造成了重大危害。2013年我國(guó)首次出現(xiàn)人感染H7N9 禽流感疫情[6]，截至目前廣州市累計(jì)報(bào)告人感染H7N9禽流感病例共計(jì)43例。2017年首次從廣東2例人感染H7N9病例分離到高致病性H7N9禽流感病毒[7]，這是H7N9禽流感病毒自感染人以來(lái)，出現(xiàn)的重要基因變異。本研究對(duì)2017年10份人感染H7N9禽流感病毒陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行基因序列測(cè)定，分析當(dāng)前本地區(qū)H7N9高致病性變異株重要蛋白變異情況和遺傳進(jìn)化特點(diǎn)，為廣州地區(qū)人感染H7N9禽流感的科學(xué)防控提供研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 采集2017年具有禽類接觸史的流感樣病例、不明原因肺炎病例的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行H7N9禽流感病毒檢測(cè)，陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)廣東省疾病預(yù)防控制中心復(fù)核確認(rèn)，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2核酸檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，參照試劑盒使用說(shuō)明書，分別進(jìn)行H7亞型和N9亞型禽流感病毒檢測(cè)。病毒核酸提取試劑盒和禽流感病毒H7N9檢測(cè)試劑盒(熒光定量PCR法)分別購(gòu)于QIAGEN公司和江蘇碩世生物科技股份有限公司。

1.3序列測(cè)定 應(yīng)用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)H7N9禽流感病毒HA、NA和M基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物，見表1，引物由華大基因合成。采用一步法RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因片段，將電泳鑒定的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至英濰捷基公司，通過(guò)ABI 3730進(jìn)行病毒一代測(cè)序。

表1 H7N9禽流感病毒HA、NA和M基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物Tab.1 Gene amplification primers of avian influenza A(H7N9) viruses

1.4基因特征分析 應(yīng)用DNA Star 7.1軟件拼接HA、NA和M基因序列并對(duì)序列進(jìn)行同源性分析。從NCBI下載廣東、浙江、安徽、江蘇、臺(tái)灣、江西等地人源、禽源和環(huán)境H7N9不同片段基因作為參比序列。采用MEGA 4.0軟件，以基因開放閱讀框?yàn)榛締卧L制HA、NA和M1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析病毒的流行進(jìn)化特點(diǎn)。繪制方法為Neighbor-joining法(參數(shù)設(shè)置為1000 replications)及Maximum composite likelihood model比對(duì)核苷酸序列。用MegAlign軟件對(duì)重要蛋白位點(diǎn)進(jìn)行基因插入、缺失和突變分析。

2 結(jié) 果

2.1同源性分析 10份毒株的HA基因核苷酸同源性在95.1%～99.2%之間，氨基酸同源性在93.6%～99.1%之間。NA基因核苷酸同源性在95.6%～99.6%之間，氨基酸同源性在93.8%～99.4%之間。M1基因核苷酸同源性在95.9%～100%之間，氨基酸同源性在98.4%～100%之間。不同基因片段最大相似度毒株見表2。

2.2分子特征 對(duì)2017年10株H7N9禽流感病毒基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，有5株病毒HA蛋白裂解位點(diǎn)為PKRKRTAR↓GLF，含有連續(xù)4個(gè)堿性氨基酸插入，呈現(xiàn)高致病性禽流感病毒分子特點(diǎn)。所有病毒的受體結(jié)合位點(diǎn)均出現(xiàn)G186V變異，其中有5株病毒出現(xiàn)Q226L變異。所有毒株在HA蛋白的毒力位點(diǎn)均出現(xiàn)D225G變異，詳見表3。HA蛋白上第30、46、249、421、493位氨基酸上的糖基化位點(diǎn)分別為NGT、NAT、NDT、NVT、NNT，其中2017XN09919病毒在136位增加了糖基化位點(diǎn)NGT。NA蛋白頸部69-73位均發(fā)生了氨基酸缺失，NA蛋白主要在42、52、63、66、87、147、202上有7個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，而2017XN01746在52位出現(xiàn)糖基化位點(diǎn)缺失，2017XN07751和2017XN29043在63位點(diǎn)出現(xiàn)缺失，而2017XN00096和2017XN27043分別在346和459位點(diǎn)增加了糖基化位點(diǎn)NNS和NWS。NA蛋白對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑耐藥的119、120、152、229、245、276、294位點(diǎn)上，有2株病毒分別出現(xiàn)E120K和R294K突變，詳見表4。M1蛋白毒力相關(guān)位點(diǎn)上，所有毒株均出現(xiàn)N30D和T215A突變。M2蛋白烷胺類藥物耐藥位點(diǎn)上，所有毒株出現(xiàn)了S31N突變，另有3株出現(xiàn)V27G突變，詳見表5。

表3 HA蛋白裂解位點(diǎn)、受體結(jié)合位點(diǎn)、毒力位點(diǎn)變異情況 Tab.3 Mutations of amino acid sites in HA protein

表4 NA蛋白頸部缺失、耐藥位點(diǎn)變異情況Tab.4 Mutations of amino acid sites in NA protein

表5 M1蛋白毒力位點(diǎn)、M2蛋白耐藥位點(diǎn)突變情況Tab.5 Mutations of amino acid sites in M1 protein

2.3遺傳進(jìn)化分析 對(duì)2017年廣州地區(qū)10株人感染H7N9禽流感病毒遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，5株高致病性變異株的HA基因與與廣東、江西分離株親緣關(guān)系較近，歸屬于同一進(jìn)化分支，屬于華南分支，另5株非變異株與上海、江蘇、浙江分離株親緣關(guān)系較近，歸屬于同一遺傳進(jìn)化分支，屬于華東分支，見圖1。NA遺傳進(jìn)化特點(diǎn)與HA較為相似，即高致病性變異株均屬于華南分支，詳見圖2。M1基因主要集中在3個(gè)不同的進(jìn)化分支，其有2株高致病性變異株與華南地區(qū)H7N9禽流感病毒親緣關(guān)系相近，屬于同一進(jìn)化分支，另3株高致病性變異株與北方H7N9禽流感病毒親緣關(guān)系相近，歸屬于同一進(jìn)化分支。非變異株分別于華南H9N2病毒和北方H7N9病毒親緣相近，歸屬于相應(yīng)分支，見圖3。

注：“●”為高致病性H7N9禽流感病毒，“■”為低致病性H7N9禽流感病毒，紅色字體為達(dá)菲耐藥株

注：“●”為高致病性H7N9禽流感病毒，“■”為低致病性H7N9禽流感病毒，紅色字體為達(dá)菲耐藥株

注：“●”為高致病性H7N9禽流感病毒，“■”為低致病性H7N9禽流感病毒，紅色字體為達(dá)菲耐藥株

3 討 論

2013 年第一次H7N9 疫情從華東地區(qū)開始直至全國(guó)多個(gè)省出現(xiàn)感染病例[8]，2013 年3月-2017年3月的5次季節(jié)性高發(fā)疫情都主要集中在我國(guó)東南沿海地區(qū)[9]。H7N9 的發(fā)病高峰期主要集中在冬、春季節(jié)，可能是因?yàn)闅鉁剌^低的環(huán)境更適合該病毒的生存[10]。廣州地區(qū)外環(huán)境長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示[11]，廣州市禽類市場(chǎng)普遍存在H7N9禽流感病毒污染，尤其以冬春最為嚴(yán)重，2017年廣州市共計(jì)檢出H7N9禽流感病例16人，發(fā)病時(shí)間均集中在2017年1月-3月，與外環(huán)境H7N9禽流感病毒流行時(shí)間相一致。本研究提取10份H7N9病例咽拭子標(biāo)本核酸，對(duì)血凝素基因(HA)、神經(jīng)氨酸酶基因(NA)和烷胺類藥物耐藥基因(M2)基因進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序，旨在掌握禽流感重要蛋白位點(diǎn)和耐藥位點(diǎn)遺傳變異情況，為掌握廣州地區(qū)人感染H7N9禽流感病毒分子流行特點(diǎn)和指導(dǎo)臨床用藥提供參考依據(jù)。

本研究結(jié)果分析顯示，與肇慶地區(qū)人感染H7N9病毒相比[12]，廣州地區(qū)H7N9禽流感病毒基因同源性差異較大，同時(shí)大部分毒株基因與廣東毒株同源性最高，部分毒株基因與河南、內(nèi)蒙古等地毒株同源性最高，呈現(xiàn)基因變異多樣性。HA蛋白即流感病毒的血凝素，也是禽流感病毒的重要表面抗原之一[13]，HA 蛋白裂解位點(diǎn)附近多堿性氨基酸序列特征可被存在于人呼吸道細(xì)胞的某些特定蛋白酶切割裂解，有利于病毒在人呼吸道的復(fù)制[14]，一般認(rèn)為HA裂解位點(diǎn)附近具有4個(gè)以上連續(xù)的堿性氨基酸插入是高致病性禽流感病毒重要的分子標(biāo)志[15]，早在2016年肇慶地區(qū)研究的7份人源H7N9禽流感病毒[12]，裂解位點(diǎn)均表現(xiàn)為2個(gè)堿性氨基酸插入，即為低致病禽流感病毒分子特點(diǎn)，該結(jié)果與浙江、安徽的序列一致[16-17]，2017年淮南分離的病毒只有1個(gè)堿性氨基酸存在[18]。直到2017年首次在病例中分離到高致病性H7N9禽流感病毒變異株。本研究也同樣發(fā)現(xiàn)，在2017年廣州病例中監(jiān)測(cè)到5株病毒的裂解位點(diǎn)出現(xiàn)4個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸插入，提示說(shuō)明廣東地區(qū)自2017年開始高致病性H7N9禽流感變異株廣泛存在。

不同宿主來(lái)源的流感病毒對(duì)唾液酸分子的識(shí)別具有特異性，人流感病毒主要優(yōu)先識(shí)別唾液酸α-2, 6半乳糖(SAα-2, 6Gal)，禽的流感病毒識(shí)別SAα-2, 3Gal[19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HA蛋白第226位、228位氨基酸起著關(guān)鍵的作用。本研究中5株病毒出現(xiàn)了Q226L的突變，提示對(duì)人呼吸道上皮細(xì)胞SAα-2, 6Gal受體結(jié)合能力增加，同時(shí)也有研究表明廣東省內(nèi)流行的人感染H7N9禽流感病毒普遍獲得與人呼吸道上皮細(xì)胞受體結(jié)合的能力[20]。糖基化位點(diǎn)主要位于禽流感病毒的HA和NA蛋白，其位置和數(shù)目的變化會(huì)影響功能蛋白進(jìn)而影響病毒的毒力和致病性[21-22]。HA蛋白糖基化位點(diǎn)主要在第30、46、249、421、493位共5個(gè)位點(diǎn)，NA蛋白糖基化位點(diǎn)主要在第42、52、63、66、87、147、202位共7個(gè)位點(diǎn)，以往研究結(jié)果中[12,18]，上述位點(diǎn)均相對(duì)保守，未出現(xiàn)缺失或增加。但本研究中，HA蛋白136位增加了1個(gè)糖基化位點(diǎn)，NA蛋白63位糖基化位點(diǎn)有缺失，而增加了341、454位糖基化位點(diǎn)。毒力相關(guān)位點(diǎn)上，包括HA蛋白D225G、M1蛋白N30D 和T215A均發(fā)生突變，同時(shí)NA蛋白均出現(xiàn)頸部氨基酸缺失，提示廣州人感染H7N9禽流感病毒毒力增強(qiáng)。

目前抗流感藥物分為兩類，一類是M2蛋白離子通道阻斷劑-烷胺類藥物，大量研究顯示H7N9禽流感病毒均出現(xiàn)S31N突變耐藥[23]，因此該類藥物臨床已少有使用。另一類為神經(jīng)氨酸酶抑制劑，為當(dāng)前人感染禽流感病毒以及暴露后預(yù)防的首選藥物，以往研究均未發(fā)現(xiàn)耐藥突變株的出現(xiàn)[12,20,23]，本研究在2017年H7N9禽流感病例中發(fā)現(xiàn)2株高致病性變異株分別出現(xiàn)E120K、R294K耐藥突變，而R294K突變可導(dǎo)致病毒對(duì)達(dá)菲的耐藥。

當(dāng)前我國(guó)流行的H7N9禽流感病毒均屬于歐亞譜系，自2013年H7N9在我國(guó)廣泛流行以來(lái)不斷進(jìn)化，主要分為以長(zhǎng)三角為中心的華東分支和以珠三角為中心的華南分支。遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，2017年廣州人感染H7N9禽流感病毒HA基因和NA基因在華南和華東分支均有分布，而高致病性變異株主要分布在華南分支，進(jìn)一步推斷華南地區(qū)為高致病性H7N9變異株的起源地。M1基因進(jìn)化特點(diǎn)相對(duì)復(fù)雜，分別與華南地區(qū)H9N2、H7N9病毒，以及北方地區(qū)的H7N9病毒重組，同一基因不同毒株進(jìn)化分支可能不同，表現(xiàn)出遺傳進(jìn)化的多樣性，同一毒株不同基因進(jìn)化分支也可能不同，表現(xiàn)出遺傳進(jìn)化的復(fù)雜性。林慕蕾等[20]在研究中指出，H7N9病毒在廣東的不同時(shí)間點(diǎn)具有遺傳多樣性，而廣州早在2014年首次出現(xiàn)本地病例以來(lái)，H7N9禽流感病毒又是經(jīng)歷了怎樣的進(jìn)化，需要進(jìn)一步回顧性研究。

疫情早期H7N9禽流感病毒的M1基因來(lái)源于華東地區(qū)的H9N2，隨著H7N9禽流感病毒傳入華南地區(qū)，內(nèi)部基因與華南地區(qū)禽流感病毒不斷發(fā)生重組[24]，本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，H7N9病毒內(nèi)部基因出現(xiàn)本地化基礎(chǔ)上，仍然不斷重組進(jìn)化，特別是本研究中，發(fā)現(xiàn)高致病性耐藥株的M1基因與北方地區(qū)H7N9病毒重組的現(xiàn)象，提示高致病性耐藥株有向華南以外地區(qū)傳播的風(fēng)險(xiǎn)。此外，大量研究表明活禽市場(chǎng)是病毒發(fā)生重組的重要場(chǎng)所，而外環(huán)境H9N2病毒長(zhǎng)期廣泛存在，可能會(huì)加速H7N9禽流感病毒重組進(jìn)化，因此應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)廣州地區(qū)H7N9禽流感病毒持續(xù)監(jiān)測(cè)。

利益沖突：無(wú)