一種改良的布魯氏菌病抗體微量凝集檢測方法的建立與評價

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布魯氏菌病(Brucellosis)由布魯菌(Brucella)侵入機(jī)體引起的一種以發(fā)熱為特征的人獸共患慢性傳染變態(tài)反應(yīng)性疾病。該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，每年新發(fā)病例超過50萬例[1]，在我國近20年持續(xù)高發(fā)，是對人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展危害最嚴(yán)重的一種傳染病[2]。布魯氏菌病的診斷技術(shù)包括血清學(xué)檢測技術(shù)和病原學(xué)檢測技術(shù)。細(xì)菌學(xué)檢測雖是診斷布魯菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在培養(yǎng)周期長、檢出率低、實驗室生物安全等問題。血清學(xué)檢測布魯氏菌抗體技術(shù)使用廣泛、生物風(fēng)險小、操作簡便，是現(xiàn)階段最常用的技術(shù)。目前我國實行的 WS269-2007《布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)》中適用的血清學(xué)檢測技術(shù)有虎紅平板凝集試驗(RBPT)、標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗 (SAT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(CFT)等。但血清學(xué)檢測技術(shù)的敏感性和特異性，不同的研究方法有不同的結(jié)果[3-4]。SAT雖然是確診布病的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，但需要大量的試管凝集抗原和患者血清，尤其在流行病學(xué)調(diào)查中，對大量標(biāo)本進(jìn)行檢測時費(fèi)時費(fèi)力。微量凝集試驗是對試管凝集試驗的改良，具有微量、簡便、穩(wěn)定性和特異性好的特點(diǎn)。本研究建立一種可顯色的布魯氏菌病抗體微量凝集檢測方法(Microagglutination Test, MAT)，可在96孔V型板上同時檢測24份標(biāo)本，且結(jié)果易判讀，更適宜基層防疫人員現(xiàn)場檢測，最終為疫情處置提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1確診病例定義 根據(jù)我國《布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS269-2007)：流行病學(xué)接觸史、臨床癥狀和 RBPT法陽性以及 SAT滴度為1∶100(++)及以上，滿足以上3項條件者確診為布病病人。

1.2主要試劑 布魯氏菌病RBPT抗原和SAT抗原由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供。

1.3顯色微量凝集抗原制備 取常規(guī)試管法抗原用虎紅染料染色，然后用生理鹽水分別稀釋成1∶5、1∶10、1∶20備用。

1.4標(biāo)準(zhǔn)陽性血清效價測定 采用SAT按我國《布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS269-2007)方法操作，用標(biāo)準(zhǔn)陰性血清對照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)陽性血清標(biāo)定，其結(jié)果應(yīng)為1∶400。

1.5顯色微量凝集抗原最佳濃度的優(yōu)化 用33份布病病人陽性血清、1份標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和1份陰性

血清按照常規(guī)SAT法，每份血清樣品分別加入1∶5、1∶10和1∶20抗原，混勻，加蓋，放入濕盒，置37 ℃溫箱，20 h取出，室溫靜置1 h觀察結(jié)果。

1.6結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) 常規(guī)SAT參照國標(biāo)WS269-2007方法，以凝集程度為“++”為最終效價；微量SAT以V型管底不出現(xiàn)非常明顯紅點(diǎn)或極小紅點(diǎn)為陽性。

1.7統(tǒng)計方法 試驗結(jié)果使用Excel進(jìn)行錄入, 對全部結(jié)果應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。兩種方法比較差異應(yīng)用卡方檢驗，P>0.05表示兩種方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1微量凝集試驗 顯色結(jié)果第1～8孔血清濃度分別為1∶50，1∶100，1∶200,1∶400,1∶800,1∶1 600,1∶3 200和……1∶6 400，MAT以V型管底不出現(xiàn)非常明顯紅點(diǎn)或極小紅點(diǎn)為陽性，部分結(jié)果見下圖1。20和64為陰性結(jié)果；29、4、12、88、89和66為陽性結(jié)果(圖中用“+”表示)，效價分別為1∶800、1∶400、1∶400、1∶200、1∶800和1∶100。

圖1 微量凝集試驗顯色結(jié)果Fig.1 Results of MAT(the part of samples)“+”means antibody positive titers

2.2抗原優(yōu)化結(jié)果 用33份陽性血清和3份陰性血清進(jìn)行測試，當(dāng)微量凝集抗原濃度為1∶10時，與SAT結(jié)果最吻合，見表1。

表1 MAT試驗抗原優(yōu)化結(jié)果Tab.1 Optimization of MAT antigen

2.3SAT和MAT結(jié)果一致性比較結(jié)果 對142個血清樣本同時做SAT和MAT，結(jié)果SAT檢測得到21份陰性樣本，22份可疑樣本(1∶50)，99份陽性樣本(>1∶100)。MAT檢測得到30份陰性樣本、17份可疑樣本(1∶50)、95份陽性樣本(>1∶100)。如圖2所示，圖中數(shù)字對應(yīng)橫縱坐標(biāo)即為試驗結(jié)果(例如MAT結(jié)果與SAT結(jié)果均為1∶200陽性的樣品個數(shù)為12)這兩種試驗方法結(jié)果相同的占70.4%(100/142)，位于對角線方格內(nèi)，結(jié)果相差1個滴度的占28.6%(40/142)，相差2個滴度的占1.4%(1/142)。兩種試驗方法相關(guān)系數(shù)為0.978。

注：此圖類似于橫縱坐標(biāo)圖，圖中數(shù)據(jù)為樣本數(shù)，對應(yīng)的橫縱坐標(biāo)分別為該樣本數(shù)對應(yīng)的SAT結(jié)果與MAT結(jié)果，空格即代表樣本數(shù)為0

2.4MAT評價指標(biāo)分析結(jié)果 以SAT為參照標(biāo)準(zhǔn)，MAT敏感度和特異度分別為分別為98.9%和92.3%；和常規(guī)試管凝集法相比，兩種方法符合率為96.5%。見表2。

表2 微量凝集試驗效果評價Tab.2 Evaluation indicators of MAT

2.5MAT和SAT兩種試驗方法統(tǒng)計學(xué)檢驗結(jié)果 用配對χ2檢驗，χ2=0.8，P>0.05，兩種方法不存在統(tǒng)計學(xué)差異，見表3。

表3 MAT與SAT兩種方法檢測血清陽性結(jié)果Tab.3 Statistical testing between MAT and SAT

3 討 論

動物布魯氏菌病診斷技術(shù)GB/T 18646-2018中，增加了試管凝集試驗中的微量法，目的就是為現(xiàn)場檢測人員提供一種操作簡易，判讀方便，成本低、通量高的一種免疫學(xué)檢測方法。目前，人布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS269-2007)中還沒有微量凝集法，也沒有商品化的微量凝集抗原，本研究不僅可為臨床及公共衛(wèi)生部門診斷布病提供一種新方法，也可為今后修改人布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)。

本研究優(yōu)化了微量凝集試驗抗原濃度，最終確定為1∶10為最適濃度，與國內(nèi)外文獻(xiàn)報道相符[5-8]。SAT和MAT兩種方法經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義，不符合的檢驗結(jié)果可能與操作誤差及肉眼判讀有關(guān)，還需大樣本量的驗證。此外，筆者還驗證了不同血清量對結(jié)果的影響，10 μL血清可以保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠，節(jié)省了樣本量。ELISA也可以對大樣本量檢測[6, 9-11]，筆者實驗室目前也在對ELISA、SAT和MAT進(jìn)行評價。

試驗結(jié)果真實性的評價指標(biāo)為靈敏度和特異度，靈敏度越高反映該試驗發(fā)現(xiàn)病人的能力越強(qiáng)；特異度越高反映該試驗確定非病人的能力越強(qiáng)?？煽啃栽u價指標(biāo)是符合率和Kappa值，這兩個指標(biāo)可以反映試驗判定的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)診斷結(jié)果的一致性[12]。ROC曲線是評價檢驗試驗的一種全面、準(zhǔn)確、有效的方法，曲線下面積反映了診斷試驗價值的大小，面積越大，越接近1.0，診斷的真實度越高。由表2可以看出，本實驗具有較高的靈敏度特異度符合率(接近100%)，Kappa值與ROC曲線下面積接近1，真實性可靠性較好。目前部分國外學(xué)者對該方法的研究結(jié)果與本實驗室的研究結(jié)果相同，說明MAT可以替代現(xiàn)有的SAT。與SAT相比，MAT的優(yōu)點(diǎn)在于：1)省時省力：在進(jìn)行大量標(biāo)本檢測時，國家規(guī)定的試管凝集法顯得費(fèi)時費(fèi)力，操作時需要反復(fù)刷洗試管和吸管，占用大量的試管架和溫箱空間，且判定結(jié)果時需要一一對比，操作起來很不方便；2)準(zhǔn)確性高：微量凝集試驗使用精密的微量移液器，避免了使用吸管所產(chǎn)生的誤差，使用一次性96孔V型板和吸頭，避免了由于試管和吸管洗刷不干凈產(chǎn)生的影響；3)成本低，結(jié)果易于判讀：由于使用的抗原(50 μL)和待檢血清(10 μL)都是微量，節(jié)省了標(biāo)本和試劑，由于采用顯色的抗原，結(jié)果判讀一目了然；4)易于推廣：微量凝集法檢測所需的待檢血清樣品的量是試管法的1/10，因此采血量明顯減少，工作量也會減少；一次可以同時檢測24份標(biāo)本，十分有利于獸醫(yī)和人醫(yī)在生產(chǎn)實踐中的推廣。

綜上所述，本研究建立了較為準(zhǔn)確、可靠的布魯氏菌病微量凝集檢測方法，發(fā)展了布病的快速檢測技術(shù)，但因樣本量較少，仍需后續(xù)研究重復(fù)驗證，以期盡快應(yīng)用于布病現(xiàn)場的快速檢測。

利益沖突：無