2016年福建省單核細(xì)胞增生李斯特菌臨床病例及食品來源菌株的分子特征分析

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單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一種重要的食源性人獸共患病原菌，老人、兒童、孕婦和免疫力低下者容易感染，可引起胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)等癥狀。孕婦感染的危險度比健康成年人高出20倍。2001年起被美國列為法定上報的疾病[1]。2011年美國一起因哈密瓜引起的李斯特菌病暴發(fā)，涉及美國28個州，導(dǎo)致147人患病，33人死亡，1例流產(chǎn)[2]，1998年，我國香港和臺灣發(fā)生李斯特菌暴發(fā)事件，甜筒、冰激凌和雪糕等被污染，造成許多兒童發(fā)病[3]。馮延芳等收集文獻(xiàn)資料統(tǒng)計：2000-2009年我國16個省共報告92例李斯特菌病例，病例臨床特征、報告死亡率等與歐美相似[4]。我國食源性疾病監(jiān)測顯示，國內(nèi)人感染單核細(xì)胞增生李斯特菌散發(fā)報告數(shù)逐年上升，2016年全國報告82例病例，主要以孕婦和新生兒為主。福建省單核細(xì)胞增生李斯特菌感染病例未見文獻(xiàn)報道。為了解福建省單核細(xì)胞增生李斯特菌感染的流行病學(xué)及病例和食品來源株的分子特征，提高溯源能力，在福建省建立3家哨點醫(yī)院，采用血清分型和PFGE分型方法對分離菌株進(jìn)行比較分析。

1 材料與方法

1.1 病例調(diào)查方法

1.1.1病例定義 具有單核細(xì)胞增生李斯特菌感染的臨床表現(xiàn)，主要為腦膜炎、敗血癥、先兆流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)等。從無菌的標(biāo)本(血液、腦脊液)或妊娠產(chǎn)物(羊水或胎盤等)中分離到單核細(xì)胞增生李斯特菌。

1.1.2監(jiān)測對象 孕婦、嬰幼兒、老人等免疫力低下者。

1.1.3病例信息采集 由臨床醫(yī)生對符合監(jiān)測病例定義的病人進(jìn)行信息采集，接到報告的疾病預(yù)防控制中心對陽性病例開展流行病學(xué)調(diào)查。

1.2 菌株來源

1.2.1病例菌株 醫(yī)院實驗室采集生物標(biāo)本按照《2016年食源性疾病監(jiān)測工作手冊》[5]進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗。3株單核細(xì)胞增生李斯特菌病例株來自2016年泉州、福州和廈門市婦幼保健院分離(其中新生兒血液標(biāo)本2份、胎盤母面標(biāo)本1份)。

1.2.2食品菌株 8株單核細(xì)胞增生李斯特菌來自2016年福建省食品微生物監(jiān)測分離株(7株分離自市售即食食品壽司，1株分離自福建某冷凍飲品廠的環(huán)境樣本)。

1.2.3單核細(xì)胞增生李斯特菌 標(biāo)準(zhǔn)菌株(CMCC 54004和CMCC54007)來自中國藥品生物制品檢定所；PFGE參考菌株沙門氏菌H9812由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所提供。

1.3試劑 APIListeria生化鑒定試劑條(法國bioM erieux)，單核細(xì)胞增生李斯特菌顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉)，血平板(北京陸橋公司)。Tap DNA聚合酶(BBI)，瓊脂糖(TakaRa)，5×TBE、1 mol/LTris-HCL緩沖液和0.5 mol/L EDTA(Solarbio)，Tris base、EDTA 和boric Acid (BBI)，N-Lauroyl-Sarcosine Sodium salt(Sarcosy1)(Sigma), 溶菌酶(Sigma)，蛋白酶K粉末(Merck)，XbaI和AscI酶(NEB)， SeaKem Gold Agarose(Gene)。多重PCR引物由上海生工公司合成。單核細(xì)胞增生李斯特菌型別免疫血清購自日本生研公司。以上培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.4儀器 核酸擴增儀(德國Biometra)，CHEF Mapper XA及凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂)，超純水儀(美國miniPALL)，臺式離心機(德國Eppendorf)，比濁儀(法國生物梅里埃)，水浴搖床(英國Grant)。

1.5 菌株鑒定與分型方法

1.5.1菌株復(fù)核 分離株均經(jīng)GB 4789.30-2010方法驗證。

1.5.2血清學(xué)分型 多重PCR測定血清型別方法采用的5對引物序列參照文獻(xiàn)[6]。免疫血清分型方法按照說明書，用玻片凝集法確定O抗原，用試管法確定H抗原。

1.5.3PFGE分子分型與聚類分析 按照單核細(xì)胞增生李斯特菌PFGE操作程序[5]進(jìn)行，選用AscI酶進(jìn)行plug中DNA的酶切，PFGE圖譜用BioNumerics 7.6軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1病例信息 2016年3例單核細(xì)胞增生李斯特菌感染病例中2例為早產(chǎn)的新生兒，1例孕婦，調(diào)查結(jié)果見表1。第1例病例抗生素治療2 d后未痊愈，家長放棄治療帶回。第2例病例為孕婦咳嗽、乏力、發(fā)燒，柴胡退熱、靜滴青霉素抗感染治療，入院查體胎心未聞及，本次妊娠為人工受精。第3例病例為新生兒敗血癥，抗生素治療后存活，其母親4周內(nèi)食用過生食蔬菜、現(xiàn)制現(xiàn)售飲料和西式沙拉。

2.2菌株復(fù)核結(jié)果 11株分離株經(jīng)鑒定均為單核細(xì)胞增生李斯特菌，API Listeria 生化鑒定編碼均為6710。

2.3血清型別 11株單核細(xì)胞增生李斯特菌株多重PCR分型結(jié)果見圖1，與傳統(tǒng)免疫血清方法結(jié)果一致，分屬3個血清型：1/2a、1/2b和4b。3株病例株中2株1/2a 型、1株4b型；8株食品株中4株1/2a來自漳州和福州的壽司、2株4b來自福州和漳州的壽司，1株1/2b來自福州的壽司，1株1/2a來自冷凍飲品廠地板分離株。

表1 2016年3例單核細(xì)胞增生李斯特菌陽性病例的臨床資料及流調(diào)信息Tab.1 Clinical and epidemiological information of three confirmed Listeria monocytogenes cases in 2016

M：100bp DNA Ladder；1-12：CMCC54004(1/2a型)、CMCC54007(4b型)、DZ-47、JDZ-02、JDZ-01、JDZ-03、JDZ-04、DZ-A16043、 DZ-A16114、DZ-E16087、DZ-E16094、DZ-E16023；13-14：空白對照組

2.4PFGE型別 11株單核細(xì)胞增生李斯特菌PFGE聚類分析結(jié)果見圖2，分為10種帶型，其中3株病例分離株的PFGE相似度小于80%，無同源性。與同年份福建省即食食品壽司中分離株的相似度不高，亦無同源性。不同血清型4b與1/2a的PFGE帶型相似度較差，為57.8%。

圖2 11株單核細(xì)胞增生李斯特菌PFGE聚類分析Fig.2 PFGE profile of 11 L. monocytogenes

3 討 論

2016年福建省監(jiān)測到的3例單核細(xì)胞增生李斯特菌病例均為免疫力低下人群(孕婦和新生兒)，發(fā)生月份集中在6～8月，符合單核細(xì)胞增生李斯特菌“夏秋季呈季節(jié)性增長”的特點[3]。已有研究表明，本病病死率可高達(dá)30%～35%[3]。連凱等[7]統(tǒng)計我國2002-2012年報告人李斯特菌感染病例80例，總病死率為19%，其中病死率最高的人群為免疫缺陷患者(40%)，其次為新生兒患者(31%)。目前，臨床上應(yīng)對李斯特菌病主要采用抗生素治療，藥物首選氨芐西林[3]。早發(fā)現(xiàn)、及時檢測、正確應(yīng)對，必要時給予合理、足量的抗生素治療可以有效防控[1]。此外，加強對高風(fēng)險人群的宣教活動，可以顯著降低單核細(xì)胞增生李斯特菌病的發(fā)生[8]。

本次監(jiān)測的單核細(xì)胞增生李斯特菌病例菌株血清型為1/2 a和4b，即食食品分離株為1/2a、1/2b和4b，均為國內(nèi)外常見的血清型。王麗麗等[9]研究北京市2013-2015年32株人源性單核細(xì)胞增生李斯特菌血清型，以1/2b和1/2a型為主，分別占53.1%和37.5%。國外報道[10]，單核細(xì)胞增生李斯特菌具有流行病學(xué)重要性的血清型有4b(占37%～64%的病例)、1/2b(占10%～35%的病例)和1/2a(占15%～25%的病例)，血清型4b引起的疾病在孕婦病例中明顯較多。福建省凍畜禽肉類等市售食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的污染率為38.46%～30.30%，30株食品分離株血清型主要以1/2a 為主，未見4b血清型[11]。2016年即食食品壽司監(jiān)測分離的7株單核細(xì)胞增生李斯特菌中發(fā)現(xiàn)2株4b血清型的菌株均來自海鮮壽司(含三文魚等)，是否與進(jìn)口海產(chǎn)有關(guān)有待進(jìn)一步調(diào)查研究。應(yīng)加強對即食食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的監(jiān)測并引起重點人群的高度關(guān)注。

本次PFGE聚類分析可以看出，病例菌株的PFGE分子型別與同年度省內(nèi)食品分離株之間無同源性，說明2016年監(jiān)測病例均為單核細(xì)胞增生李斯特菌散發(fā)病例，且病例分離株與監(jiān)測到的即食食品分離株之間無相關(guān)性。由于李斯特菌病潛伏期長，臨床癥狀容易被忽略，流行病學(xué)調(diào)查中對可疑致病食品的回顧難度大，病原菌較難追蹤溯源。應(yīng)借鑒國外監(jiān)測經(jīng)驗，納入法定上報疾病，建立病例分離株的型別數(shù)據(jù)分析和比對，及時對聚集性病例進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和快速溯源，摸清流行規(guī)律，采取針對性的防治措施，才能減少單核細(xì)胞增生李斯特菌病的發(fā)生。

利益沖突：無