CD40信號(hào)聯(lián)合細(xì)胞因子體外制備過(guò)繼免疫治療細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究①

高騰飛 古彥錚 徐俊馳 沈 宇 李曉晨 朱一蓓 張學(xué)光

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，蘇州 215013)

腫瘤的過(guò)繼細(xì)胞免疫治療(Adoptive cellular immunotherapy，ACI)是繼腫瘤的手術(shù)治療、放療、化療后的第四種治療方式，并日受到重視［1］。主要原理是采集腫瘤患者外周血中單個(gè)核細(xì)胞、經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)、擴(kuò)增出一定數(shù)量的具有腫瘤殺傷能力的細(xì)胞，再回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)［2］。其中細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞(CIK)在培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞增殖速度快、具有一定的殺傷腫瘤活性、對(duì)多種耐藥腫瘤細(xì)胞均較為敏感［3］，在當(dāng)今腫瘤的過(guò)繼細(xì)胞免疫治療中被廣泛應(yīng)用。它的主要效應(yīng)細(xì)胞是CD3+CD56+細(xì)胞［4］。但是CIK細(xì)胞在治療中存在一定不足，所以臨床療效達(dá)不到預(yù)期的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)建立一種新的過(guò)繼免疫細(xì)胞誘導(dǎo)方案:CD40激發(fā)型單抗5C11聯(lián)合細(xì)胞因子IFN-α、IL-7和IL-2(CD40激發(fā)組)體外制備過(guò)繼免疫治療細(xì)胞，并與常規(guī)CIK(CD3激發(fā)組)進(jìn)行對(duì)比性分析，為臨床腫瘤過(guò)繼免疫治療提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院收集正常人外周血來(lái)源的PBMC，標(biāo)本征得本人及其家屬同意，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 抗人CD3單克隆抗體(OKT-3)、IL-2、IFN-γ、IL-1α、IL-7 和 IFN-α 均購(gòu)自美國(guó)的 PeproTech公司;激發(fā)型CD40抗體來(lái)自本研究所研制，克隆號(hào)為5C11;淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司;小牛血清、RMPI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Hyclone公司;CD56-FITC、CD3-PE、CD4-PE-Cy7、CD8-PE-Cy5、CD14-PE、CD11c-PECy5、CD25-PE-Cy5和Foxp3-FITC熒光抗體均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司;Foxp3檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。

1.3 過(guò)繼免疫治療細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)及形態(tài)觀察

將PBMC細(xì)胞用RMPI1640完全培養(yǎng)基(含10%小牛血清)配成細(xì)胞懸液，然后轉(zhuǎn)入6孔板(5.0×106/孔)和24孔板(3.0×105/孔)里，然后于各組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入相應(yīng)細(xì)胞因子:CD3激發(fā)組起始時(shí)(即第0天)加入 IFN-γ(1 000 U/ml)，24 h后再加入 IL-2(1 000 U/ml)、IL-1α(100 U/ml)和抗CD3mAb(50 ng/ml);CD40激發(fā)組起始時(shí)(即第0天)加入5C11(2 μg/ml)，IL-7(10 ng/ml)，IFN-α(5 ng/ml)，IL-2(300 U/ml)。然后將培養(yǎng)板放到37℃、5%CO2、飽和濕度95%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。之后，視細(xì)胞狀態(tài)每隔2～3 d即每3 d補(bǔ)一次細(xì)胞因子液，其中CD3激發(fā)組僅補(bǔ)加IL-2(1 000 U/ml)，而CD40激發(fā)組則補(bǔ)加全部4種細(xì)胞因子5C11(2 μg/ml)、IL-7(10 ng/ml)、IFN-α(5 ng/ml)和 IL-2(300 U/ml)。每天觀察，并拍照記錄。

1.4 CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組細(xì)胞增殖情況分析 在細(xì)胞培養(yǎng)的第6、9、12天收集適量細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染液(10 μl)以1∶1混合均勻，在 3 min 內(nèi)，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞，鏡下觀察，死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染呈無(wú)色透明狀，最后按照公式:(細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù))/ml=(四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)×稀釋倍數(shù)×104統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞數(shù)量。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞免疫表型 在第9天分別收集CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組培養(yǎng)的過(guò)繼免疫治療細(xì)胞。①T細(xì)胞、NKT細(xì)胞和Mo-NK-DC細(xì)胞組成的流式檢測(cè):加入適量的FITC、PE、PE-Cy5或者PE-Cy7熒光素標(biāo)記的混合抗體，包括 CD56、CD3、CD4、CD8、CD14 和 CD11c，震蕩，4℃避光孵育30 min，加入適量PBS 洗滌，震蕩，1 500 r/min，5 min離心，棄上清液，加入500 μl PBS，流式細(xì)胞儀機(jī)器上檢測(cè)。②Treg細(xì)胞組成的流式檢測(cè):應(yīng)用Foxp3檢測(cè)試劑盒，在加入CD4-PE和CD25-PE-Cy7熒光素標(biāo)記的混合抗體并4℃避光孵育30 min后，使用固定劑4℃避光孵育90 min，然后使用破膜劑同時(shí)加入Foxp3-FITC熒光素標(biāo)記的抗體，4℃避光孵育30 min，最后經(jīng)過(guò)同①的方法處理后流式細(xì)胞儀機(jī)器上檢測(cè)。③數(shù)據(jù)文件使用Flowjo軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 體外擴(kuò)增的過(guò)繼免疫細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 體外培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)觀察顯示，CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的集落樣增殖，CD3激發(fā)組的集落較大，而CD40激發(fā)組的集落要略小而密，但二者在形態(tài)上無(wú)明顯差異，均表現(xiàn)為胞體和胞核增大，胞漿增多，漿中出現(xiàn)顆粒、空泡等特征(見(jiàn)圖1)。

2.2 兩組過(guò)繼免疫細(xì)胞增殖速率的動(dòng)態(tài)比較 本實(shí)驗(yàn)使用24孔板體外培養(yǎng)過(guò)繼免疫治療細(xì)胞，起始接種量為3.0×105/孔，在培養(yǎng)的第6、9、12天使用臺(tái)盼藍(lán)法對(duì)培養(yǎng)的過(guò)繼免疫治療細(xì)胞進(jìn)行活力計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)CD3激發(fā)組的細(xì)胞增殖速度略快于CD40激發(fā)組(見(jiàn)圖2)。體外培養(yǎng)第12天時(shí)，CD3激發(fā)組的細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到了接種時(shí)的24倍左右(3.0×105～7.12×106)，這與經(jīng)典的過(guò)繼免疫治療細(xì)胞增殖速度(細(xì)胞數(shù)量平均增加25倍)一致，而CD40激發(fā)組培養(yǎng)的過(guò)繼免疫治療細(xì)胞到第12天時(shí)，細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到了接種時(shí)的20倍左右。

圖1 CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Cell morphology of CD3 and CD40 agonist groups

圖2 CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組的細(xì)胞增殖曲線圖Fig.2 Cell growth curve of CD3 and CD40 agonist group

圖3 CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組的T淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況Fig.3 Expression of T lymphocyte in CD3 and CD40 agonist group

圖4 CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組的CD3+CD56+細(xì)胞的表達(dá)情況Fig.4 Expression of CD3+CD56+cells in CD3 and CD40 agonist group

圖5 CD40激發(fā)組的Treg細(xì)胞比例顯著低于CD3激發(fā)組Fig.5 Treg cell percentage of CD40 agonist group is significantly lower than of CD3 agonist group

2.3 CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組的T淋巴細(xì)胞亞群分析 在培養(yǎng)的第9天收集培養(yǎng)的過(guò)繼免疫治療細(xì)胞，檢測(cè)其CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細(xì)胞群體的變化狀況。結(jié)果顯示，CD3激發(fā)組的 CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細(xì)胞比例分別在(42.8%±7.56%)和(52.6% ±8.34%)左右，而CD40激發(fā)組的CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細(xì)胞頻率分別在(44.3% ±9.45%)和(48.7% ±6.18%)左右，兩組間無(wú)顯著差異(P＞0.05，見(jiàn)圖3)。

2.4 CD40激發(fā)組的NK-T(CD3+CD56+)細(xì)胞比例顯著高于CD3激發(fā)組 在培養(yǎng)的第9天收集過(guò)繼免疫治療細(xì)胞，檢測(cè)其CD3+CD56+細(xì)胞群體的變化狀況。結(jié)果顯示，CD3激發(fā)組的CD3+CD56+細(xì)胞比例為(15.3% ±4.12%)，CD40激發(fā)組的CD3+CD56+細(xì)胞比例為(25.6% ±5.34%)，兩組之間存在顯著差異(P＜0.05，見(jiàn)圖4)。

2.5 CD40激發(fā)組的Treg細(xì)胞比例低于CD3激發(fā)組 在培養(yǎng)的第9天收集過(guò)繼免疫治療細(xì)胞，檢測(cè)其Treg細(xì)胞的變化。結(jié)果顯示，CD40激發(fā)組過(guò)繼免疫治療細(xì)胞中Treg細(xì)胞的頻率顯著低于CD3激發(fā)組，兩組有顯著差異(P＜0.05，見(jiàn)圖5)。

2.6 CD40激發(fā)組出現(xiàn)獨(dú)特的Mo-NK-DC樣細(xì)胞群體 在培養(yǎng)的第9天收集培養(yǎng)的過(guò)繼免疫治療細(xì)胞，檢測(cè)其 CD14+CD56+和 CD56+CD11c+細(xì)胞的變化狀況。結(jié)果顯示，CD40激發(fā)組培養(yǎng)的過(guò)繼免疫治療細(xì)胞中出現(xiàn)一群特殊的Mo-NK-DC樣細(xì)胞群體，而在CD3激發(fā)組幾乎未出現(xiàn)(見(jiàn)圖6)。

圖6 CD40激發(fā)組出現(xiàn)獨(dú)特的Mo-NK-DC樣細(xì)胞群體(CD14+CD11c+/CD56+CD11c+)Fig.6 There occurs an unique set of Mo-NK-DC like cell group in CD40 agonist group(CD14+CD11c+/CD56+CD11c+)

3 討論

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的重要疾病之一。目前，手術(shù)、放療和化療仍是主要的治療手段，但各種原因都可導(dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)，以致死亡率甚高。過(guò)繼細(xì)胞免疫治療(ACI)正成為當(dāng)今繼放化療后治療惡性腫瘤的一種新的治療手段，主要通過(guò)取自體或異體免疫細(xì)胞，在細(xì)胞因子誘導(dǎo)下大量擴(kuò)增具有抗腫瘤活性的淋巴細(xì)胞回輸給腫瘤病人，介導(dǎo)患者的抗腫瘤免疫力［5］。

雖然常規(guī)以 CD3McAb聯(lián)合細(xì)胞因子 IL-2，IFN-γ，IL-1α誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞治療是目前最為常用的方案，但存在著一些亟待解決的療效不佳問(wèn)題:由于用大劑量IL-2維持后期T細(xì)胞的增殖，大劑量IL-2會(huì)誘導(dǎo)一定數(shù)量的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)［6］，這可能是影響CIK療效的關(guān)鍵因素。鑒于常規(guī)CIK培養(yǎng)方案的不足，尋找更為有效的過(guò)繼免疫細(xì)胞體外誘導(dǎo)方案始終是腫瘤免疫研究的熱點(diǎn)。

CD40信號(hào)是抗原提呈細(xì)胞(APC)的分化及功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)途徑［7］;CD40信號(hào)激發(fā)可增強(qiáng)單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)的生存能，促進(jìn)單核細(xì)胞的殺瘤活性［8，9］，以致對(duì)T細(xì)胞和APC細(xì)胞的功能均產(chǎn)生重要影響［10］。IFN-α 可提高 CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和 NK細(xì)胞對(duì) IFN-γ的表達(dá)，并平衡Th1/Th2免疫應(yīng)答［11］;IFN-α還能有效地?cái)U(kuò)增CD8+T細(xì)胞，提高其細(xì)胞活性［12］;還有研究發(fā)現(xiàn)，IFN-α還可以促進(jìn)DC細(xì)胞的活化和增加NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性［13］，因此被用于抗病毒感染和癌癥免疫治療中。研究表明，IL-7能刺激初始和記憶淋巴細(xì)胞增殖，同時(shí)IL-7協(xié)同促進(jìn)T細(xì)胞成熟，向Th1細(xì)胞分化，抑制細(xì)胞凋亡［14］;IL-7對(duì)淋巴細(xì)胞的各個(gè)亞群包括CD8+和CD4+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞等均有促進(jìn)增殖、活化和調(diào)節(jié)作用。已有研究顯示，IL-7正逐漸成為腫瘤免疫應(yīng)答和腫瘤免疫治療研究的熱點(diǎn)之一［15］。

本研究顯示，盡管CD40激發(fā)組的細(xì)胞增殖數(shù)量略低于CD3激發(fā)組，但是這對(duì)要求數(shù)量的過(guò)繼免疫治療回輸細(xì)胞沒(méi)有影響。衛(wèi)生部“人體細(xì)胞治療臨床研究質(zhì)控要點(diǎn)”和中國(guó)免疫學(xué)會(huì)制定的“過(guò)繼性免疫治療癌癥規(guī)范”規(guī)定每例患者需平均治療2個(gè)療程，每療程回輸細(xì)胞總數(shù)應(yīng)不少于5×109個(gè)［16］，通過(guò)血細(xì)胞分離儀采集的 PBMC，完全能達(dá)到治療要求的數(shù)量，我們只需在培養(yǎng)前根據(jù)需要取足量PBMC即可。

我們研究發(fā)現(xiàn)，與CD3激發(fā)組相比，CD40激發(fā)組體外誘導(dǎo)的過(guò)繼免疫細(xì)胞中，Treg比例明顯下降，而CD3+CD56+NKT細(xì)胞比例顯著增加，并且培養(yǎng)細(xì)胞群體里出現(xiàn)一群新的細(xì)胞群體，即表達(dá)CD14、CD56和CD11c分子的Mo-NK-DC樣細(xì)胞，這群細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能也有待探討。綜上所述，本研究通過(guò)CD40單克隆抗體聯(lián)合細(xì)胞因子IFN-α和IL-7能有效擴(kuò)增過(guò)繼免疫細(xì)胞，降低Treg細(xì)胞比例同時(shí)提高了抗腫瘤能力的NKT細(xì)胞，該方法可能為腫瘤細(xì)胞過(guò)繼免疫治療提供又一嶄新的途徑。

［1］Wang ZX，Cao JX，Liu ZP，et al.Combination of chemotherapy and immunotherapy for colon cancer in China:A meta-analysis［J］.World J Gastroenterol，2014，20(4):869-1126.

［2］Wang XP，Xu M.Intraperitoneal perfusion of cytokine-induced killer cells with local hyperthermia for advanced hepatocellular carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2013，19(19):2841-2978.

［3］蔣敬庭.細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞抗腫瘤機(jī)制及應(yīng)用［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2012，30(10):837-842.

［4］郭 智，陳惠仁.細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞體外培養(yǎng)的初步研究［J］.中華臨床醫(yī)師雜志，2011，5(21):6318-6321.

［5］Beloki L，Ciáurriz M.The abrogation of TCR-independent interactions with human serum ensures a selective capture of therapeutic virus-specific CD8(+)T-cells by Multimer Technology in Adoptive Immunotherapy［J］.J Immunol Methods，2013，396(1-2):168-172.

［6］Sandra Hervas-Stubbs，Jose Luis Perez-Gracia，Ana Rouzaut，et al.Direct effects of type I interferons on cells of the immune system［J］.Clin Cancer Rese，2011，17(9):2619-2627.

［7］Agnieszka Anna Rucki，Zheng Li.Pancreatic cancer stroma:understanding biology leads to new therapeutic strategies［J］.World J Gastroenterol，2014，20(9):2127-2428.

［8］Khalifeh MS ，Stabel JR.Clinical disease upregulates expression of CD40 and CD40L on peripheral blood mononuclear cells from cattle naturally infected with mycobacterium avium subsp.paratuberculosis［J］.Clin Vaccine Immunol，2013，20(8):1274-1282.

［9］Li D，Zhong Y.Autocrine TNF-α-mediated NF-κB activation is a determinant for evasion of CD40-induced cytotoxicity in cancer cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，436(3):467-472.

［10］文麗君，劉海燕.淋巴細(xì)胞表面CD40分子的表達(dá)和作用［J］.免疫學(xué)雜志，2011，27(5):448-450.

［11］Jiang W ，Zhang Ch.IFN-α gene modification augments human natural killer cell line anti-human hepatocellular carcinoma function［J］.Gene，2013，20(4):1062-1069.

［12］Sachdeva R，Shilpi RY.The interplay between the X-DING-CD4，IFN-α and IL-8 gene activity in quiescent and mitogen-or HIV-1-exposed PBMCs from HIV-1 elite controllers，AIDS progressors and HIV-negative controls［J］.Innate Immun，2013，20(7):173-183.

［13］Zhang ZR ，Duan YC.Interferon Alpha 2b for Treating Patients with JAK2V617F Positive Polycythemia Vera and Essential Thrombocytosis［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15(4):1681-1684.

［14］Juan Ramón Larrubia，Megha Uttam Lokhande.Role of T cell death in maintaining immune tolerance during persistent viral hepatitis［J］.World J Gastroenterol，2013，19(2):1855-2010.

［15］Pérez-Bercoff L ，Vudattu NK.Reduced IL-7 responsiveness defined by signal transducer and activator of transcription 5 phosphorylation in T cells may be a marker for increased risk of developing cytomegalovirus disease in patients after hematopoietic stem cell transplantation［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2014，20(1):128-132.

［16］Zhihua W.CIK cell therapy for cancer:Current status of international clinical trials and future prospects［J］.Chin J Cancer Biother，2013，20(2):129-137.