HIF-1α與ERBB4在食管鱗癌中的表達(dá)及意義

崔曼莉, 張 超, 張明鑫, 王景杰

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 710038；*通訊作者，E-mail：zmx3115@163.com)

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HIF-1α與ERBB4在食管鱗癌中的表達(dá)及意義

崔曼莉, 張 超, 張明鑫, 王景杰

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 710038；*通訊作者，E-mail：zmx3115@163.com)

目的 探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α)和ERBB4在人食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)組織中的表達(dá)，并分析兩者表達(dá)的臨床病理意義以及兩者的相關(guān)性。 方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)65例ESCC組織和50例癌旁組織HIF-1α與ERBB4的表達(dá)，分析其與臨床病理特征的關(guān)系以及兩者表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果 HIF-1α與ERBB4在ESCC組織中的表達(dá)的強(qiáng)陽(yáng)性率分別為83.1%，76.9%，明顯高于癌旁組織(30%和24.7%)(P<0.05)；且在分化程度較低、有淋巴轉(zhuǎn)移以及TNM分期較晚的患者中，HIF-1α和ERBB4呈現(xiàn)顯著高表達(dá)(P<0.05)；而與患者的年齡、性別、是否吸煙、是否飲酒、病變長(zhǎng)度以及病變位置均無(wú)關(guān)(P>0.05)；HIF-1α表達(dá)與ERBB4表達(dá)之間具有相關(guān)性(r=0.629，P<0.05)。 結(jié)論 HIF-1α與ERBB4在ESCC中高表達(dá)，提示HIF-1α/ERBB4信號(hào)通路可能在ESCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

HIF-1α； ERBB4； 食管鱗癌

食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是亞洲最為常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，且我國(guó)約有占全球一半的ESCC患者，故ESCC的預(yù)防診治研究意義重大[1]。腫瘤組織增生過(guò)快可以造成局部組織嚴(yán)重缺氧，而腫瘤組織的缺氧在腫瘤形成病理過(guò)程中異常重要，與腫瘤治療耐受、惡性進(jìn)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α)在腫瘤細(xì)胞耐受缺氧并保持增殖活力的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，新近研究提示HIF-1α可通過(guò)靶向ERBB4調(diào)控乳腺分化，并在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3,4]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)HIF-1α與ERBB4表達(dá)關(guān)系及其與食管鱗癌關(guān)系的研究尚罕見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)免疫組化SP法檢測(cè)HIF-1α與ERBB4的表達(dá)，并分析兩者表達(dá)的臨床病理意義以及兩者的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

搜集第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院2013-01～2014-12間行食管癌手術(shù)切除的患者標(biāo)本，要求所有病例術(shù)前均未行化療、放療以及免疫治療，選取病理資料詳實(shí)且術(shù)后病理證實(shí)為ESCC的患者65例，其中男37例，女28例，年齡36-70歲，中位年齡48.5歲。同時(shí)在距癌組織邊緣>5 cm處的食管正常組織取標(biāo)本作為癌旁對(duì)照，最終經(jīng)HE 染色確認(rèn)為無(wú)癌組織浸潤(rùn)，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的癌旁組織共計(jì)50例。標(biāo)本用體積分?jǐn)?shù)10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制備4 μm切片，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)觀察。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 HIF-1α兔抗人多克隆抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品(sc-10790)，ERBB4兔抗人多克隆抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品(bs-1085R)，稀釋后作為一抗，通用型SP系列工作液試劑盒(SP-9000)及DAB顯色試劑盒(ZLI-9032)購(gòu)自中山金橋生物公司。采用免疫組化SP法，染色步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以已知陽(yáng)性反應(yīng)片作為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)關(guān)血清代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.2 結(jié)果判定 由兩位高年資病理科醫(yī)生獨(dú)立評(píng)定，當(dāng)出現(xiàn)分歧時(shí)共同評(píng)定。蛋白表達(dá)均以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，判定方法如下：每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，用各視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的平均百分?jǐn)?shù)作為該切片的陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行計(jì)分：0%-24%為1分，25%-49%為2分，50%-74%為3分，>75%為4分。染色強(qiáng)度以多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特征為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分：細(xì)胞未著色或呈淡黃色為0分，棕黃色為1分，棕褐色為2分。為進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以超過(guò)25%細(xì)胞呈棕褐色為陽(yáng)性，余為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用卡方檢驗(yàn)。所有的檢驗(yàn)均為雙側(cè)，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α和ERBB4在ESCC組織內(nèi)的表達(dá)

陽(yáng)性細(xì)胞呈片狀分布的棕褐色顆粒，陰性對(duì)照未見(jiàn)棕黃色顆粒。陽(yáng)性染色呈散在分布的淡黃色或棕褐色顆粒，HIF-1α定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，而ERBB4主要定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜(圖1)。HIF-1α在ESCC中的陽(yáng)性率為83.1%，而在癌旁組織中的陽(yáng)性率為30%，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ERBB4在ESCC中的陽(yáng)性率為76.9%，而在癌旁組織中的陽(yáng)性率為24.7%，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

圖1 HIF-1α與ERBB4在ESCC和癌旁組織中的表達(dá) Figure 1 Expression of HIF-1α and ERBB4 in ESCC and non-tumor adjacent tissues (NAT)

表1 HIF-1α與ERBB4在ESCC中的表達(dá)

Table 1 Expression of HIF-1α and ERBB4 in ESCC

組織nHIF-1αERBB4低表達(dá)高表達(dá)χ2P低表達(dá)高表達(dá)χ2P食管鱗癌65115433.1730.000155031.8570.000癌旁組織5035153812

2.2 HIF-1α和ERBB4在ESCC中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

65例患者ESCC組織內(nèi)HIF-1α高表達(dá)者54例，ERBB4高表達(dá)者50例。卡方檢驗(yàn)顯示，HIF-1α和ERBB4的表達(dá)與病理分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，即在分化程度較低、有淋巴轉(zhuǎn)移以及TNM分期較晚的患者中，HIF-1α和ERBB4呈現(xiàn)高表達(dá)。而與患者的年齡、性別、是否吸煙、是否飲酒、病變長(zhǎng)度以及病變位置均無(wú)關(guān)(P>0. 05，見(jiàn)表2)。

表2 HIF-1α與ERBB4的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性例

Table 2 Relationship between the expression of HIF-1α and ERBB4 and clinicopathological features of ESCC cases

臨床特征nHIF-1αERBB4低表達(dá)高表達(dá)χ2P低表達(dá)高表達(dá)χ2P年齡0.0370.8460.4490.503 <60歲437361132 ≥60歲22418418性別1.3690.2460.0750.784 男37829928 女28325622是否吸煙1.0460.3060.0090.923 是446381034 否21516516是否喝酒0.1530.6951.3510.245 是21318318 否448361232TNM分期14.2990.00013.0000.000 Ⅰ-Ⅱ2610161214 Ⅲ-Ⅳ39138336是否淋巴轉(zhuǎn)移6.7620.0094.7820.029 否3610161224 是29128326分化程度7.2510.0124.1470.042 低23023221 高+中4211311329長(zhǎng)度0.3650.5460.0330.855 >5cm29425722 ≤5cm36729828位置0.0060.9411.0860.297 下段+中段42735716 上段23419834

2.3 HIF-1α和ERBB4在ESCC中表達(dá)的相關(guān)性

采用卡方檢驗(yàn)對(duì)ESCC組織中HIF-1α與ERBB4表達(dá)水平的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在54例HIF-1α強(qiáng)表達(dá)的標(biāo)本中，有48例ERBB4強(qiáng)表達(dá)，在11例HIF-1α弱表達(dá)的標(biāo)本中，有9例ERBB4弱表達(dá)；二者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有相關(guān)性(P<0.05，見(jiàn)表3)，χ2換算成Pearson列聯(lián)系數(shù)r為0.629，相關(guān)性較強(qiáng)。

表3 HIF-1α與ERBB4在ESCC中表達(dá)的相關(guān)性

Table 3 Correlation between HIF-1α and ERBB4 expression in ESCC

ERBB4HIF-1α低表達(dá)高表達(dá)χ2Pr 低表達(dá)9625.7370.0000.629 高表達(dá)248

3 討論

缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是調(diào)控細(xì)胞缺氧應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，近年來(lái)一系列研究提示其可通過(guò)激活一系列基因表達(dá)參與多種生物學(xué)過(guò)程從而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。HIF-1是一個(gè)包含α亞基和β亞基的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，其中β亞基持續(xù)表達(dá)，而α亞基通過(guò)感知氧壓力決定HIF-1的活性[6]。大量研究證實(shí)HIF-1α在包括ESCC的多種組織中表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮癌基因功能[7]。meta分析顯示，ESCC中HIF-1α表達(dá)與腫瘤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病分期、治療耐受以及生存顯著相關(guān)[8]。我們通過(guò)免疫組化研究了HIF-1α在ESCC中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，其在ESCC中高表達(dá)，與病理分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)，與已有報(bào)道結(jié)果相符[8]。

ERBB4(HER4)屬于表皮生長(zhǎng)因子受體家族，調(diào)控著多種細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、生存、侵襲與分化，在腫瘤中發(fā)揮重要作用[9]。在ESCC中，ERBB4表達(dá)與預(yù)后關(guān)系密切，且可作為潛在的分子靶標(biāo)[10,11]。在ESCC的miRNAs研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-520a和miR-302b均可通過(guò)靶向ERBB4發(fā)揮抑癌基因功能[12,13]。免疫組化結(jié)果顯示，ESCC中ERBB4高表達(dá)與病理分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)，說(shuō)明其發(fā)揮癌基因功能。

HIF-1α基因敲除鼠的研究揭示了其對(duì)ERBB4的調(diào)控及機(jī)制：HIF-1α敲除后ERBB4的表達(dá)下調(diào)，上調(diào)HIF-1后則可以激活ERBB4依賴的乳腺癌細(xì)胞的分化；體外研究中顯示ERBB4的活性與乳腺癌細(xì)胞的增殖關(guān)系密切，而在4 552例腫瘤及正常組織中，ERBB4與HIF-1α已知的靶基因密切相關(guān)[3,4]。因此，HIF-1α通過(guò)靶向ERBB4調(diào)控乳腺分化，并在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但兩者在食管鱗癌中的相關(guān)關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道，我們的研究提示，HIF-1α與ERBB4在ESCC組織中的表達(dá)具有相關(guān)性(r=0.629,P<0.05)，提示在ESCC中HIF-1α也可能對(duì)ERBB4有調(diào)控作用，且HIF-1α/ERBB4信號(hào)通路應(yīng)該在ESCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但具體機(jī)制及相關(guān)功能，仍有待進(jìn)一步探討。下一步可通過(guò)RNA干擾食管鱗癌細(xì)胞系(如Eca109等)抑制HIF-1α后，查看對(duì)ERBB4表達(dá)的影響，并通過(guò)熒光素報(bào)告基因明確調(diào)控機(jī)制，為ESCC的預(yù)防診治提供新的靶點(diǎn)和思路。

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Expression and clinical significance of HIF-1α and ERBB4 in esophageal squamous cell carcinoma

CUI Manli, ZHANG Chao, ZHANG Mingxin*, WANG Jingjie

(DepartmentofGastroenterology,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,China;*Correspondingauthor,E-mail:zmx3115@163.com)

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of HIF-1α and ERBB4 in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC).MethodsImmunohistochemistry(SP assay) was used to detect the expression of HIF-1α and ERBB4 in 65 patients with ESCC and 50 non-tumor adjacent tissues(NAT). The relationship between their expression and clinical features was analyzed，and their correlation was also demonstrated.ResultsThe positive expression rate of HIF-1α and ERBB4 was 83.1% and 76.9% in ESCC,respectively, significantly higher than that of NAT(30.0% and 24.7% respectively,P<0.05). And over-expression of HIF-1α and ERBB4 was correlated with tumor differentiation, lymph node metastasis and TNM stage(P<0.05), but showed no statistical associated with sex,age,drink,smoke,tumor length,and location.The expression of HIF-1α was positively correlated with expression of ERBB4(r=0.629，P<0.05).ConclusionHIF-1α and ERBB4 are over-expressed in ESCC, implicating that HIF-1α/ERBB4 signal pathway might play important roles in the ESCC development.

HIF-1α; ERBB4; esophageal squamous cell carcinoma

國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目(81302055)

崔曼莉，女，1979-03生，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：xixi0011@163.com

2016-06-27

R735.1

A

1007-6611(2016)09-0830-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.09.011