響應(yīng)面法優(yōu)化麥麩酯酶提取工藝

葉 麟，楊 雪,2，張志清，申光輝，黎杉珊，吳賀君，高 瑋，陳思瑩

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014； 2.攀枝花市食品藥品檢驗(yàn)所，四川攀枝花 617000)

響應(yīng)面法優(yōu)化麥麩酯酶提取工藝

葉 麟1，楊 雪1,2，張志清1，申光輝1，黎杉珊1，吳賀君1，高 瑋1，陳思瑩1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014； 2.攀枝花市食品藥品檢驗(yàn)所，四川攀枝花 617000)

為提高小麥加工副產(chǎn)物麥麩的利用率，從中提取植物酯酶，并優(yōu)化麥麩酯酶的提取工藝，本研究以NaNO3-磷酸緩沖液為溶劑對(duì)麥麩酯酶進(jìn)行水浴靜置提取，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken試驗(yàn)，進(jìn)一步研究了NaNO3濃度、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素的交互作用對(duì)麥麩酯酶活力的影響。最終確定麥麩酯酶的最佳提取工藝為NaNO3濃度0.15 moL·L-1、提取溫度35 ℃、提取時(shí)間60 min，此條件下單位酶活的預(yù)測(cè)值為23 338 U·mL-1，驗(yàn)證值為23 018.7 U·mL-1，達(dá)到預(yù)測(cè)值的98.63%。綜上所述，此優(yōu)化條件能夠較好地從麥麩中提取植物酯酶，并保持較高的酶活性。

麥麩；植物酯酶；提取工藝；響應(yīng)面優(yōu)化

我國(guó)是小麥生產(chǎn)大國(guó)，年產(chǎn)量已超過(guò)1億t，年產(chǎn)麩皮可達(dá)2 000萬(wàn)t以上[1-2]。利用麥麩提取的植物酯酶(plant esterase,PE)可用于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的快速檢測(cè)[3-4]，因具有和膽堿酯酶相似的檢測(cè)限而被越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注[5-7]。PE屬于羧酸酯水解酶類，廣泛存在于小麥、玉米等谷物中[8-9]。陳士恩等[10-11]、江媛媛等[12]分別采用蒸餾水、磷酸緩沖液振蕩提取法從小麥、大豆等植物中提取了PE。吳 定等[13]的研究結(jié)果表明，從小麥粉中提取酯酶較動(dòng)物提取酯酶方法簡(jiǎn)便、成本低。王振寧等[14]研究了鹽溶液提取對(duì)植物酯酶的影響，確定NaCl鹽溶液的提取效果最佳。本研究以小麥加工副產(chǎn)物麥麩為原料，采用單因素試驗(yàn)確定各因素對(duì)麥麩PE提取效果的影響，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，以期為深入研究麥麩酯酶的酶學(xué)性質(zhì)提供技術(shù)參考，為小麥副產(chǎn)物麥麩的深加工利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

麥麩為雅安市售，粉碎后過(guò)80目篩，以100目篩上物為試驗(yàn)材料。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 麥麩酯酶的提取

取5 g供試麥麩，加入25 mL 0.2 mol·L-1PBS(磷酸氫鈉)緩沖液，攪拌均勻后于35 ℃水浴靜置60 min，紗布粗過(guò)濾，4 ℃、8 000 r·min-1冷凍離心5 min，取上清液即得粗酶液，測(cè)定酶活時(shí)需先稀釋。

1.2.2 α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取0.25 mL不同濃度α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液至4.5 mL pH 7.2的PBS緩沖液中，40 ℃恒溫水浴5 min；加入0.25 mL 0.03%固蘭B鹽、0.25 mL 4.25%SDS溶液，混勻；加入0.25 mL1∶1鹽酸溶液；599 nm處讀取OD值。未加α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白。以α-萘酚濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 酶活力測(cè)定

參照王振寧等[14]方法并稍作修改。將粗酶液用去離子水稀釋5倍后，取0.25 mL稀釋液至4.25 mL pH 7.2的PBS緩沖液中，其余測(cè)定步驟同1.2.2，未加麥麩酯酶溶液作空白。

酶活力=[(C1-C2)×N×V1]/(5×V2)

式中，C1為樣品的α-萘酚濃度(μmol·mL-1) ；C2為空白對(duì)照的α-萘酚濃度(μmol·mL-1)；V1為反應(yīng)液總體積(mL)；V2為樣品反應(yīng)時(shí)所吸稀釋液的體積(mL)；N為酶液稀釋倍數(shù)；5為測(cè)定反應(yīng)時(shí)間(min)。

1.2.4 影響麥麩酯酶活性的主要因素選擇試驗(yàn)

(1)提取方式的選擇：蒸餾水為提取劑、料液比1∶5、提取溫度為35 ℃、提取時(shí)間60 min條件下，分別采用水浴靜置、氣浴震搖以及超聲破碎3種方式提取酯酶，通過(guò)測(cè)定酶活確定最優(yōu)提取方式。

(2)pH值緩沖液的選擇：分別以pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的PBS(0.2 mol·L-1)緩沖液和蒸餾水為提取劑，料液比1∶5、35 ℃最優(yōu)方式提取60 min，通過(guò)測(cè)定酶活確定最優(yōu)pH值緩沖液。

(3)鹽類型的選擇：以上述最優(yōu)pH值緩沖液配制0.15 mol·L-1NaCl、Na2SO4、NaNO3、KCl 4種中性鹽溶液，以最優(yōu)pH值緩沖液為提取液，料液比為1∶5、35 ℃最優(yōu)方式下提取60 min后，通過(guò)測(cè)定酶活確定最優(yōu)鹽類型。

(4)鹽溶液濃度的選擇：以選擇出的最優(yōu)pH值緩沖液分別配置0.025、0.05、0.1、0.15和0.2 mol·L-1濃度的上述最優(yōu)鹽溶液為提取液，料液比1∶5，35 ℃最優(yōu)方式提取60 min，通過(guò)測(cè)定酶活確定最優(yōu)提取液濃度。

(5)提取溫度的選擇：在以上最優(yōu)條件下，料液比1∶5，分別在25、30、35、40和45 ℃最優(yōu)方式提取60 min，通過(guò)測(cè)定酶活確定最優(yōu)提取溫度。

(6)提取時(shí)間的選擇：在以上最優(yōu)條件下，料液比1∶5，提取40、60、80、100和120 min，通過(guò)測(cè)定酶活確定最優(yōu)提取時(shí)間。

(7)料液比的選擇：在以上最優(yōu)條件下，分別以料液比(m/v)為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8提取麥麩酯酶，通過(guò)測(cè)定酶活確定最優(yōu)料液比。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，利用Design-Expert 10軟件，以X1、X2、X3……為試驗(yàn)因子，以麥麩酯酶活性為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸方程擬合及其優(yōu)化分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與作圖；采用SPSS 22對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析；采用Design Expert 10對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

通過(guò)對(duì)不同濃度的α-萘酚吸光值的測(cè)定，得到α-萘酚濃度(X)與吸光值Y之間的線性回歸方程為Y=834.57X-0.127 2，R2為0.999 5，說(shuō)明線性關(guān)系較好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 提取方式對(duì)單位酶活的影響

由圖1可知，水浴靜置提取出來(lái)的酯酶活性最大(20 038.66 U·mL-1)，顯著高于氣浴振搖和超聲波破碎方式。氣浴振搖(12 824.57 U·mL-1)和超聲波破碎(11 181.41 U·mL-1)提取的酯酶活性無(wú)顯著差異?？赡苁怯捎谡駬u過(guò)程中，細(xì)胞與細(xì)胞之間的摩擦、碰撞等機(jī)械力過(guò)大[6]，破壞了細(xì)胞中活性物質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶活偏低；而超聲提取可能由于空化效應(yīng)中，空化泡破裂時(shí)產(chǎn)生瞬時(shí)高溫(5 000℃)、高壓(500×104Pa)，導(dǎo)致多聚物降解、酶失活、脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞殺傷等[15-16]。故選用水浴靜置方式提取麥麩酯酶。

圖柱上不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Different small letters above column mean significant differerce among treatments at 0.05 level. The same below.

圖1 不同提取方式對(duì)麥麩酯酶活性的影響

Fig.1 Effect of different extraction methods on wheat bran esterase activity

2.2.2 pH值磷酸緩沖液對(duì)單位酶活的影響

由圖2可知，pH 6.5的PBS緩沖液提取效果最好(23 301.92 U·mL-1)，且顯著高于蒸餾水(P<0.05)。而pH 7.5的緩沖液提取效果最差(19 468.61 U·mL-1)，可能pH 太大對(duì)酶的構(gòu)象穩(wěn)定性有較大影響，引起了酶蛋白的聚集、變形等，造成酶活降低[17]。

圖2 不同pH值緩沖液對(duì)麥麩酯酶活性的影響

2.2.3 鹽類型對(duì)麥麩酯酶單位酶活的影響

由圖3可知，NaNO3緩沖液提取的酶活性最大(21 138.13 U·mL-1)，NaCl次之(20 204.52 U·mL-1)，均顯著高于pH 6.5緩沖液提取的效果(18 996.31 U·mL-1)。說(shuō)明加入NaNO3鹽有利于提高麥麩酯酶的活性。這是因?yàn)樵谔崛∫褐屑尤肷倭康腘aNO3，可增加蛋白質(zhì)分子表面的電荷，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子與水分子的作用，從而使蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度增大[18-19]。

圖3 不同提取液對(duì)麥麩酯酶活性的影響

2.2.4 鹽溶液濃度對(duì)麥麩酯酶單位酶活的影響

由圖4可知，在本試驗(yàn)NaNO3濃度下，酶活先升高后降低，濃度為0.15 mol·L-1時(shí)酶活達(dá)到最高(21 665.35 U·mL-1)，且顯著高于其他濃度(P<0.05)。說(shuō)明低濃度的NaNO3可使酶的溶解度增加，而過(guò)高的NaNO3濃度使麥麩酯酶處于高滲透壓的環(huán)境中，破壞了蛋白質(zhì)在水中存在的兩個(gè)穩(wěn)定因素(水化層和電荷)，進(jìn)而發(fā)生鹽析作用，使蛋白質(zhì)沉淀，導(dǎo)致酶活降低[20]。

圖4 不同NaNO3濃度對(duì)麥麩酯酶活性的影響

圖5 不同提取溫度對(duì)麥麩酯酶活性的影響

2.2.5 提取溫度對(duì)麥麩酯酶單位酶活的影響

由圖5可知，隨著提取溫度的升高，酶活先增后減，35 ℃時(shí)酶活達(dá)到最大值(24 960.46 U·mL-1) ，且顯著高于其他溫度的酶活。溫度過(guò)高，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)容易發(fā)生改變或變性，使酶活降低；另外，溫度還可以影響氨基酸側(cè)鏈的離子化，通過(guò)影響pH值而影響某個(gè)活性基團(tuán)或整個(gè)反應(yīng)體系，從而改變酶活性[21]。

2.2.6 提取時(shí)間對(duì)麥麩酯酶單位酶活的影響

由圖6可知，提取時(shí)間40～60 min時(shí)，酶活隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升至最大(22 390.27 U·mL-1) 且顯著高于其他處理；60 min以后酶活逐漸下降，80～120 min時(shí)，酶活趨于穩(wěn)定。由于酶蛋白在溶液狀態(tài)下構(gòu)象不穩(wěn)定，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，麥麩中的其他成分物質(zhì)易發(fā)生氧化[22-23]、降解[24-25]等反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使酶活降低。因此選擇提取時(shí)間為60 min。

圖6 不同提取時(shí)間對(duì)麥麩酯酶活性的影響

圖7 不同料液比對(duì)麥麩酯酶活性的影響

2.2.7 料液比對(duì)麥麩酯酶單位酶活的影響

由圖7可知，隨著料液比的不斷增大，麥麩酯酶的單位酶活不斷下降；而酯酶的總酶活逐漸上升，當(dāng)料液比達(dá)到1∶7之后，總酶活趨于穩(wěn)定。料液比過(guò)低造成麥麩酯酶提取率偏低，過(guò)大的料液比則會(huì)不利于后續(xù)分離純化，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且不經(jīng)濟(jì)。綜合考慮，選取料液比1∶5為最佳。在后續(xù)試驗(yàn)中以單位酶活力作為考察指標(biāo)。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 因素與水平的選擇

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇連續(xù)變量中對(duì)酶活影響顯著的NaNO3濃度(X1)，提取時(shí)間(X2)，提取溫度(X3)作為影響因子，以酶活為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，因素編碼及水平見表1。

2.3.2 回歸模型的建立與檢驗(yàn)

響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2，每個(gè)試驗(yàn)做3組平行，取其平均值。采用Design Expert 10軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到麥麩酯酶活性對(duì)NaNO3濃度(X1)、提取時(shí)間(X2)、提取溫度(X3)的二元多項(xiàng)式回歸模型為：

表1 響應(yīng)面分析因素水平表

Table 1 Factors tested in response surface analysis

水平Level因素 FactorNaNO3濃度(X1)NaNO3concentration/(mol·L-1)提取時(shí)間(X2)Extractiontime/min提取溫度(X3)Extractiontemperature/℃-10．10403000．15603510．208040

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 2 Box-Behnken design and results of response surface analysis

試驗(yàn)號(hào)TestnumberX1：NaNO3濃度NaNO3concentration/(mol·L-1)X2：提取時(shí)間Extractiontime/minX3：提取溫度Extractiontemperature/℃單位酶活Unitenzymeactivity/(U·mL-1)10．10403520285．120．20803520141．830．20603020231．340．20604019547．150．10603020252．360．15603523432．770．10803519995．680．15603523215．390．10604020281．2100．15804020120．9110．20403519892．8120．15803020122．4130．15403020336．1140．15603523237．7150．15603523321．2160．15603523462．1170．15404020114．7

表3 回歸方程方差分析及回歸系數(shù)顯著性分析

Table 3 Analysis of variance for the established regression model

方差來(lái)源Source平方和Sumofsquares自由度df均方MeansquareF值FvalueP顯著性Significance模型Model37143519．4594127057．72265．24<0．0001??X1125305．191125305．198．050．0251?X27689．24917689．240．490．5048X39．64×10419．64×1046．200．0416?X1X27．25×10417．25×1044．660．0677X1X3127127．901127127．908．170．0244?X2X31．21×10411．21×1040．780．4073X211．18×10711．18×107759．45<0．0001??X221．05×10711．05×107675．29<0．0001??X231．05×107110518676．71676．02<0．0001??殘差Residual108917．41715559．63失擬項(xiàng)Lackoffit59239．09319746．361．590．3245純誤差Pureerror4．97×104412419．58總離差Cortotal37252436．8616

**：P<0.01；*：P<0.05.

2.3.3 麥麩酯酶提取工藝條件的確定及驗(yàn)證

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design-Eepert 10軟件獲得了酯酶提取的最佳工藝條件為：NaNO3濃度0.15 mol·L-1、提取溫度34.84 ℃、提取時(shí)間59.77 min，此條件下酶活的預(yù)測(cè)值為23 338.0 U·mL-1。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，考慮到實(shí)際操作的可行性，實(shí)際提取工藝條件修訂為：NaNO3濃度0.15 mol·L-1、提取溫度35 ℃、提取時(shí)間60 min。在以上優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得酶活平均值為23 018.7 U·mL-1，與預(yù)測(cè)值較為接近。

圖8 NaNO3濃度與提取溫度交互作用對(duì)麥麩酯酶活性影響的響應(yīng)面(A)及等高線(B)圖

3 討 論

目前，對(duì)植物酯酶的提取原料主要集中于植物種子，如小麥、大豆、玉米、豇豆等[12,26-28]，對(duì)于這些原料加工副產(chǎn)物的植物酯酶利用則少見報(bào)道。李紹中等[25]得出小麥中植物酯酶的最佳提取工藝為以含0.1 mol·L-1NaCl水溶液為提取劑(1∶5)攪拌提取。溫艷霞等[29]對(duì)比了振蕩與攪拌對(duì)小麥酯酶的提取效果，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)方式提取的酯酶活性無(wú)顯著差異。本研究結(jié)果表明，水浴靜置提取效果顯著高于振搖和超聲波破碎提取，具體原因有待進(jìn)一步研究。江媛媛[26]發(fā)現(xiàn)0.04 mol·L-1pH 7.0的緩沖溶液提取小麥中的植物酯酶效果顯著高于蒸餾水。熊曉輝等[30]發(fā)現(xiàn)用0.15 mol·L-1NaCl水溶液提取小麥中的植物酯酶的效果顯著高于蒸餾水。王振宇等[14]認(rèn)為0.164 mol·L-1NaCl 水溶液提取小麥中的植物酯酶效果顯著高于PBS緩沖液。本研究發(fā)現(xiàn)0.15 mol·L-1NaNO3pH 6.5緩沖液(0.2 mol·L-1的PBS)提取效果顯著高于蒸餾水和PBS緩沖液，可能因?yàn)楹倭恐行喳}的提取液能一定程度提高酶的溶解性，從而增加提取效率。

4 結(jié) 論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，建立了麥麩酯酶提取工藝參數(shù)的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，經(jīng)檢驗(yàn)該模型合理可靠。對(duì)麥麩酯酶酶活影響的主要因素依次為NaNO3濃度>提取溫度>提取時(shí)間，NaNO3濃度與提取溫度的交互作用對(duì)麥麩酯酶酶活影響顯著。麥麩酯酶的最佳提取條件為NaNO3濃度0.15 mol·L-1、提取溫度35 ℃、提取時(shí)間60 min。

[1] 王麗麗,陶海騰,徐同成,等.麥麩酚類化合物研究進(jìn)展[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2013,18(12):36.

WANG L L,TAO H T,XU T C,etal.Research on phenolic compounds of wheat bran [J].FoodandNutritioninChina,2013,18(12):36.

[2] 鄭青煥,李曉萍,郭 超,等.21 份印度小麥高分子谷蛋白亞基,醇溶蛋白及品質(zhì)分析[J].麥類作物學(xué)報(bào),2016,36(1):62.

ZHENG Q H,LI X P,GUO C,etal.Identification of HMW-GS,gliadin and quality property of twenty-one indian wheats [J].JournalofTriticeaeCrops,2016,36(1):62.

[3] VIDAL J C,ESTEBAN S,GIL J,etal.A comparative study of immobilization methods of a tyrosinase enzyme on electrodes and their application to the detection of dichlorvos organophosphorus insecticide [J].Talanta,2006,68(3):791.

[4] YIN H,AI S,XU J,etal.Amperometric biosensor based on immobilized acetylcholinesterase on gold nanoparticles and silk fibroin modified platinum electrode for detection of methyl paraoxon,carbofuran and phoxim [J].JournalofElectroanalyticalChemistry,2009,637(1):21.

[5] 王亞飛,張金艷.農(nóng)藥殘留檢測(cè)用植物酯酶源的篩選[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(4):375.

WANG Y F,ZHANG J Y.Screening of pesticide residue detection with botanical esterase [J].JiangsuAgriculturalSciences,2011,39(4):375.

[6] 溫艷霞.植物酯酶的篩選純化及其對(duì)農(nóng)藥敏感性的研究[D].西安:陜西師范大學(xué),2006:58.

WEN Y X.Studies on screening and purification of phytoesterase and its sensitivities to pesticide residues [D].Xi'an:Shaanxi Normal University,2006:58.

[7] HOU C J,HE K,YANG L M,etal.Catalytic characteristics of plant-esterase from wheat flour [J].WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology,2012,28(2):541.

[8] BEAUGRAND J,CRNIER D,DEBEIRE P,etal.Arabinoxylan and hydroxycinnamate content of wheat bran in relation to endoxylanase susceptibility [J].JournalofCerealScience,2004,40(3):223.

[9] 曹 健,師俊玲.食品酶學(xué)[M].鄭州:鄭州大學(xué)出版社,2011:222.

CAO J,SHI J L.Food Enzymology [M].Zhengzhou:Zhengzhou University Press,2011:222.

[10] 陳士恩,羅振興,霍生東,等.小麥酯酶分離純化及酶促反應(yīng)條件優(yōu)化的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2012(3):76.

CHEN S E,LUO Z X,HUO S D,etal.Study on isolation and purification of wheat esterase and enzymatic reaction conditions optimization [J].HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicine,2012(3):76.

[11] 陳士恩,申曉蓉,羅振興,等.植物酯酶分離純化及酶促反應(yīng)條件優(yōu)化的研究[J].西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,33(1):41.

CHEN S E,SHEN X R,LUO Z X,etal.Study on isolation and purification of plant esterase and enzymatic reaction conditions optimization [J].JournalofNorthwestMinoritiesUniversity(NaturalScienceEdition),2012,33(1):41.

[12] 江媛媛,劉 芳,陳慶川,等.農(nóng)藥檢測(cè)用植物酯酶的篩選及提取正藝優(yōu)化[J].食品與機(jī)械,2012,28(2):69.

JIANG Y Y,LIU F,CHEN Q C,etal.Selection of phyto esterases used in pesticide residues detection and extraction process optimization [J].FoodandMachinery,2012,28(2):69.

[13] 吳 定,鞠興榮,劉長(zhǎng)鵬,等.小麥粉中植物酯酶提取、純化及應(yīng)用研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2007,22(2):8.

WU D,JU X R,LIU C P,etal.Extraction,purification and application of plant-esterase from wheat flour [J].JournaloftheChineseCerealsandOilsAssociation,2007,22(2):8.

[14] 王振宇,王 濤.小麥酯酶提取純化工藝的研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2009,9(3):92.

WANG Z N,WANG T.Studies on the extraction and purification technology of wheat esterase [J].JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnology,2009,9(3):92.

[15] 張 嬋,鄭爽英.超聲空化效應(yīng)及其應(yīng)用[J].水資源與水工程學(xué)報(bào),2009,20(1):136.

ZHANG C,ZHENG S Y.Effect of ultrasonic cavitation and its application [J].JournalofWaterResourcesandWaterEngineering,2009,20(1):136.

[16] 張 斌,許莉勇.超聲萃取技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,36(5):558.

ZHANG B,XU L Y.Research and application advance of ultrasound extraction [J].JournalofZhejiangUniversityofTechnology,2008,36(5):558.

[17] JESIONOWSKI T,ZDARTA J,KRAJEWSKA B.Enzyme immobilization by adsorption:A review[J].Adsorption,2014,20(5-6):801.

[18] 周艷明,劉 丹,胡 睿,等.有機(jī)磷農(nóng)殘檢測(cè)用植物酯酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)的研究[J].食品科技,2008(3):53.

ZHOU Y M,LIU D,HU R,etal.Study on purification and characterization of plant-esterase for detecting the residues of organophosphate pesticides [J].FoodScienceandTechnology,2008(3):53.

[19] 步宇翔.蛋白質(zhì)電子跳躍轉(zhuǎn)移與溶劑化電子結(jié)構(gòu)[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)( 理學(xué)版),2011,46(10):152.

BU Y X.Electron hopping transfer in proteins and structures of solvated electrons [J].JournalofShandongUniversityScience,2011,46(10):152.

[20] 吳少輝,劉光明.蛋白質(zhì)分離純化方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥業(yè),2012,21(1):1.

WU S H,LIU G M.Research progresses in protein separation and purification [J].ChinaPharmaceuticals,2012,21(1):1.

[21] 李紹中,黃曉東,高新義,等.植物膽堿酯酶提取新工藝的研究[J].食品科技,2007(4):41.

LI S Z,HUANG X D,GAO X Y,etal.Study on botanical esterase extraction craft [J].FoodScienceandTechnology,2007(4):41.

[22] 楊立紅,高興喜,繆 靜,等.斑玉蕈酸性磷酸酯酶的酶學(xué)性質(zhì)研究[J].菌物學(xué)報(bào),2011,30(5):744.

YANG L H,GAO X X,MIAO J,etal.Enzymic properties of acid phosphatase fromhypsizygusmarmoreus[J].Mycosystema,2011,30(5):744.

[23] 阮長(zhǎng)青,楊 娟,郭德軍.不同植物酯酶對(duì)α-乙酸萘酯催化活性研究[J].食品科學(xué),2009(13):183.

RUAN C Q,YANG J,GUO D J.Catalytic activity of esterases from different crops to α-naphthalene acetic acid [J].FoodScience,2009(13):183.

[24] 溫艷霞,李建科.有機(jī)磷農(nóng)殘檢測(cè)用植物酯酶的研究[J].食品科學(xué),2006,27(4):123.

WEN Y X,LI J K.Phytoesterase study on detecting the residues of organophosphate pesticides [J].FoodScience,2006,27(4):123.

[25] 趙武玲.基礎(chǔ)生物化學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2008:136.

ZHAO W L.Fundamentals of Biochemistry [M].Beijing:China Agricultural University Press,2008:136.

[26] 江媛媛.有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)用植物酯酶的研究[D].長(zhǎng)沙:中南林業(yè)科技大學(xué),2012:17.

JIANG Y Y.The Researches on phytoesterase used for the detection of organophosphorus pesticides [D].Changsha:Central South University of Forestry and Technology,2012:17.

[27] 穆隨選.有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留檢測(cè)用豇豆酯酶的初步研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2009:21.

MU S X.Elementary research onVignaunguiculata(linn.) esterase used for detecting organophosphorus and carbamate pesticides residues [D].Yangling:Northwest A&F University,2009:21.

[28] 胡曉燕.有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)植物酯酶的抑制及應(yīng)用研究[D].杭州:浙江工業(yè)大學(xué),2009:29.

HU X Y.Research and application on plant-esterase inhibition by organophosphorous pesticides [D].Hangzhou:Zhejiang University of Technology,2009:29.

[29] 溫艷霞,李建科,張曉敏,等.植物酯酶法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性和檢測(cè)限的研究[J].食品科學(xué),2006,27(9):186.

WEN Y X,LI J K,ZHANG X M,etal.Studies on sensitivity and detection limit of phytoesterase on organophosphate pesticides [J].FoodScience,2006,27(9):186.

[30] 熊曉輝,丁安幫,游京晶,等.小麥酯酶提取及其對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)初探[J].糧食與油脂,2010(9):35.

XIONG X H,DING A B,YOU J J,etal.Extraction of wheat esterase and detection of organophosphorus pesticide [J].Cereals&Oils,2010(9):35.

Optimization of Extraction Process for Wheat Bran Esterase by Response Surface Methodology

YE Lin1,YANG Xue1,2,ZHANG Zhiqing1,SHEN Guanghui1,LI Shanshan1,WU Hejun1,GAO Wei1,CHEN Siying1

(1.College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an,Sichuan 625014,China;2.Panzhihua Institute of Food and Drug Control,Panzhihua,Sichuan 617000,China)

In order to improve the utilization of by-product of wheat bran,plant esterase can be extracted from wheat bran. The extraction of plant esterase from wheat bran with sodium hydrogen phosphate buffer as extraction solvent was optimized. On the basis of single-factor experiments,the Box-Behnken center-united experimental design principles were used to design the experiment and the response surface analysis of three factors(concentration of NaNO3,extraction temperature and time)were determined. The optimum extraction conditions were recommended 0.15 mol·L-1as sodium nitrate,35 ℃ as extraction temperature and 60 minutes as extraction time. Based on these conditions,the predicted value of the unit enzymatic activity was 23 338 U·mL-1,and its verified value was 23 018.7 U·mL-1,which was 98.63% agreed with the predicted value. To sum up,the optimized conditions are able to better extraction of plant esterase from wheat bran,and maintain a high enzyme activity.

Wheat bran; Plant esterase; Extraction technology; Response surface method

時(shí)間：2017-03-07

2016-06-03

2016-07-02

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)科雙支計(jì)劃項(xiàng)目(03572107)

E-mail：yelinyy@hotmail.com 通訊作者：張志清(E-mail:zqzhang721@163.com)

S512.1；Q814.1

A

1009-1041(2017)03-0420-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170307.1639.042.html