固定化木瓜蛋白酶的研究

　　摘 要： 近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)固定化酶的載體和固定化方法進(jìn)行了大量的研究，取得了一定的成果，有些成果已應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)直接利用包埋凝膠法，以海藻酸鈉為載體，對(duì)木瓜蛋白酶的固定化條件，以及固定化酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步的研究。實(shí)驗(yàn)對(duì)載體的濃度、載體與酶的比例，以及固定化酶顆粒大小等諸方面對(duì)固定化酶的影響進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)確定了固定化酶的最佳固定化條件。并對(duì)固定化酶的催化特性進(jìn)行了初步的研究，測(cè)定了固定化酶的最適pH值，最適溫度和米氏常數(shù)Km；同時(shí)還對(duì)固定化酶的熱穩(wěn)定性，固定化酶的酶活性等問題進(jìn)行了研究。
　　關(guān)鍵詞： 固定化 木瓜蛋白酶 酶活性
　　
　　1.材料和方法
　　1.1材料
　　本實(shí)驗(yàn)所用的材料主要有海藻酸鈉（化學(xué)純，進(jìn)口分裝），木瓜蛋白酶（MERCK公司產(chǎn)品），氯化鈣（化學(xué)純），三氯乙酸（化學(xué)純），酪蛋白（化學(xué)純），等等。儀器主要有721型分光計(jì)，恒溫槽，恒溫?cái)嚢铏C(jī)等。
　　1.2方法
　　1.2.1木瓜蛋白酶的固定方法
　　取一定量的木瓜蛋白酶溶于一定pH值的水溶液中，再加入適量的海藻酸鈉，攪拌均勻，形成膠狀體。靜置一段時(shí)間至膠體中的氣泡全部逸去，用膠頭滴管吸取該膠體，在距離液面約20厘米的高度上，滴入高濃度的CaCl溶液中。滴入溶液中的膠體里含有海藻酸鈉，會(huì)與氯化鈣溶液中的Ca2+迅速反應(yīng)，形成直徑約為3毫米的凝膠珠。待反應(yīng)一段時(shí)間后，凝膠珠沉淀下來，此時(shí)就可將凝膠珠撈出，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?br/>　　1.2.2酶活性的測(cè)定
　　1.2.2.1木瓜蛋白酶酶活性的測(cè)定
　　取一定量的木瓜蛋白酶干粉，溶于5毫升0.1N pH=6.8的巴比妥納一HCl緩沖液中 ，在30℃水溶液中保溫預(yù)熱15分鐘 ，加入同樣預(yù)熱的0.5%酪蛋白溶液5毫升 ，在30℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)20分鐘，立即加入5毫升 10%三氯乙酸溶液，以終止其反應(yīng)。靜置15分鐘后過濾。同時(shí)作一對(duì)照管，即取同量的酶粉制成同樣的酶液后，先加入5毫升 10%三氯乙酸，再加入0.5%酪蛋白溶液，在30℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)20分鐘，取出靜置15分鐘后過濾。取三支試管并編號(hào)，分別加入樣品濾液，對(duì)照液和水各2毫升， 然后各加入斐林一酚試劑A5毫升 ，混勻后再加入0.5毫升斐林一酚試劑B，在30℃水浴中顯色15分鐘。在660鈉米處以加水的管為空白測(cè)樣液和對(duì)照液的光吸收值。
　　酶活性以在30℃，pH=6.8的條件下水解酪蛋白每分鐘產(chǎn)生酪氨酸1微克作為一個(gè)酶活單位。
　　1.2.2.2固定化木瓜蛋白酶酶活性測(cè)定
　　以上述方法——斐林一酚法來測(cè)定固定化木瓜蛋白酶的酶活性。但不同的是在保溫反應(yīng)過程中應(yīng)不斷振蕩試管，以避免酶促反應(yīng)只在局部進(jìn)行。
　　2.結(jié)果與分析
　　2.1固定化條件和選擇
　　2.1.1不同pH值對(duì)固定化酶制備的影響。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，選用pH在3.0到9.0的范圍內(nèi)不同pH值的緩沖液制備固定化酶并測(cè)定其活性。結(jié)果表明，pH值對(duì)固定化酶制備后的活性有影響，在微偏酸性時(shí)所制備的固定化酶的酶活性較高。這可能與載體海藻酸鈉和木瓜蛋白酶的結(jié)構(gòu)有關(guān)。
　　2.1.2不同溫度對(duì)固定化酶制備的影響，在實(shí)驗(yàn)時(shí)，選用在5℃～60℃范圍內(nèi)取不同溫度條件制備固定化酶，并測(cè)固定化酶的活性。結(jié)果表明，固定化酶的制備應(yīng)在較溫和的條件下進(jìn)行，溫度太高或太低都會(huì)使固定化酶的活性降低。實(shí)驗(yàn)表明，控制溫度在10℃～30℃范圍內(nèi)制備固定化酶，其活性較高。
　　2.2固定化酶的催化特性
　　2.2.1最適pH值。取一定量的固定化酶，其他條件下不變，在pH值3.0～9.0范圍內(nèi)取不同pH值的緩沖液中用0.5%酪蛋白溶液為底物，在30℃保溫反應(yīng)20min后，測(cè)定它們的活性。結(jié)果表明，固定化酶的最適pH在6.5～7.0間。
　　2.2.2最適溫度。取一定量的固定化酶，其他條件不變，以0.5%酪蛋白溶液為底物，在30℃～100℃范圍內(nèi)，每隔5℃振蕩保溫20分鐘，然后測(cè)其活性。結(jié)果表明，固定化酶的最適溫度為55℃～60℃，在溫度為85℃時(shí)，仍具有較高的活性。由此可見，固定化酶可以在較高的溫度條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)。這可能是由于膠體顆粒的外層對(duì)顆粒內(nèi)部的酶起保護(hù)作用。
　　2.2.3米氏常數(shù)Km值的變化。取相同量的固定化酶和可溶性酶在最適反應(yīng)條件下，對(duì)不同濃度的酪蛋白溶液反應(yīng)10分鐘，求出酶促反應(yīng)的速度。以反應(yīng)速度和底物濃度作雙倒數(shù)圖，求出Km值。結(jié)果表明，固定化酶的Km值比可溶性酶的Km值高，這是由于經(jīng)固定后，大部分酶包埋在膠體顆粒內(nèi)部所致。
　　2.3固定化酶的熱穩(wěn)定性
　　取一定量的酶粉制成的溶液酶和含有同量酶的固定化酶分別在25℃～85℃范圍內(nèi)的不同溫度下保溫30分鐘，冷卻后在最適條件下測(cè)定酶活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，固定酶在60℃以上，溶液酶在50℃以上處理30分鐘，活力逐漸下降。
　　2.4可溶性酶溶液與固定化酶活性的比較
　　取一定量的酶粉制成的酶溶液與含有等量酶的固定化酶，在最適條件下分別測(cè)定其酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，固定化酶的酶活性僅為酶溶液酶活性的35％～40%。隨著膠體顆粒直徑的減小，固定化酶的酶活性有所提高；這是由于經(jīng)固定后，大部分的酶被包埋在膠體顆粒內(nèi)部。因此，減小膠體顆粒的直徑可提高固定化酶的活性。
　　3.討論
　　目前，固定化酶技術(shù)已成為酶工程研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一，廣泛地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)（如生產(chǎn)高果糖糖漿、氨基酸等）、生化制藥（如生產(chǎn)抗生素、核酸、蛋白質(zhì)、抗體、高純度蛋白酶等）、生物傳感器，以及環(huán)境保護(hù)（如生產(chǎn)葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅?、生活污水和工業(yè)廢水中有害成分的吸附等）。
　　本實(shí)驗(yàn)采用海藻酸鈉作為載體制作固定化酶是一種方法簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、條件溫和、制備效果良好的固定化方法。在實(shí)際操作過程中，具有穩(wěn)定性能好、機(jī)械性能好、顆粒均勻，流速快，半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛地應(yīng)用于各種飲料的抗混濁、抗沉淀等生產(chǎn)中。在本實(shí)驗(yàn)中，避免使用交聯(lián)劑，減少酶活性在固定化過程中的損失，提高了固定化酶的利用效率。在生產(chǎn)實(shí)踐中，作為載體的海藻酸鈉膠體顆粒直徑要取多少，才能使固定化酶既發(fā)揮較高的活性又有利于操作，還有待于進(jìn)一步研究。
　　
　　參考文獻(xiàn)：
　?。?］肖海軍，賀筱蓉.固定化酶及其應(yīng)用研究進(jìn)展.生物學(xué)通報(bào)，2001.
　　 注：“本文中所涉及到的圖表、公式、注解等請(qǐng)以PDF格式閱讀”