中藥馬蹄香和5種治療胃腸病藥物中氨基酸含量的測定和比較
2011-12-29 00:00:00肖樺楊成金張峻等
云南中醫(yī)中藥雜志 2011年11期
摘要：目的：深入研究馬蹄香治療病毒性腸炎的有效成分和作用機制。方法：本研究應(yīng)用國家標準GB/T5009124-2003高效液相法測定馬蹄香散劑和5種治療胃腸病藥物中氨基酸的含量。結(jié)果：谷氨酸和精氨酸在5種治療胃腸病藥物中的含量均較高，谷氨酸的含量：L-谷氨酰胺呱侖酸鈉>復(fù)方谷氨酰胺>蒙脫石散>馬蹄香>鹽酸小檗堿片>參苓健脾胃顆粒。精氨酸的含量：復(fù)方谷氨酰胺>馬蹄香>蒙脫石散>鹽酸小檗堿片>參苓健脾胃顆粒。纈氨酸的含量：蒙脫石散>馬蹄香>復(fù)方谷氨酰胺>鹽酸小檗堿片>參苓健脾胃顆粒。在蒙脫石散和復(fù)方谷氨酰胺中丙氨酸的含量高于馬蹄香。在蒙脫石散中天冬氨酸的含量高于馬蹄香。鹽酸小檗堿片中的組氨酸、甲硫氨酸高于馬蹄香。在L-谷氨酰胺呱侖酸鈉中胱氨酸、賴氨酸和甲硫氨酸的含量高于馬蹄香。其余氨基酸在馬蹄香中的含量均高于其他藥物。結(jié)論：馬蹄香散劑中含有豐富的氨基酸，其谷氨酸和精氨酸的含量比較高，這些氨基酸的含量與馬蹄香治療病毒性腸炎的有效性即促進受損腸黏膜修復(fù)可能有關(guān)。
關(guān)鍵詞：馬蹄香；高效液相；胃腸??；藥物；氨基酸
中圖分類號：R284文獻標識碼：A
文章編號：1007-2349（2011）11-0067-03
研究已證明營養(yǎng)物質(zhì)尤其是氨基酸如谷氨酰胺（Gln）、谷氨酸和精氨酸，在維持腸道健康和功能方面起著重要的作用。馬蹄香用于治療樹鼩人工感染輪狀病毒腸炎，取得良好的止瀉效果，腸黏膜絨毛呈修復(fù)過程[1]。馬蹄香用于治療輪狀病毒腸炎患兒，是安全有效的，無任何不良反應(yīng)[2]。動物急性和亞急性毒性實驗證明，馬蹄香無任何毒副反應(yīng)，對人和動物血象、肝腎功能及心臟無明顯影響[3]。為深入認識馬蹄香治療病毒性腸炎的有效成分和作用機制，本研究測定了馬蹄香散劑和５種治療胃腸病藥物中氨基酸的含量，以便利于馬蹄香制劑的推廣和應(yīng)用。
1藥物樣品和來源
（1）馬蹄香散劑由中國軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所（長春）提供；（2）蒙脫石散由博福-益普生（天津）制藥有限公司生產(chǎn)（批號：U0115）；（3）鹽酸小檗堿片由杭州民生藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)（批號：T09K518）；（4）復(fù)方谷氨酰胺腸溶膠囊由地奧集團成都藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)（批號：090719）；（5）參苓健脾胃顆粒由昆明中藥廠有限公司（批號：091221）；（6）L-谷氨酰胺呱侖酸鈉顆粒由壽制藥株式會社生產(chǎn)（批號：Z39M）。
2測定方法
21儀器和試劑美國Waters600系統(tǒng)，2487紫外檢測器，M32色譜數(shù)據(jù)工作站，Waters氨基酸水解標準液，AccQTagUltraaEluentA（美國Waters公司提供）AccQTagUltraaEluentB（美國Waters公司提供），WatersAccQ-Fluor試劑盒（美國Waters公司提供），乙腈（美國Fisher公司，色譜純），水為超純水，核桃（購自昆明金馬正昌果品批發(fā)市場）。
22試驗方法
221色譜條件色譜柱：WatersAccQ-Tag氨基酸分析柱46mm×150mm；紫外檢測波長：248nm；柱溫：55℃；按標準行梯度洗脫；理論塔板數(shù)以谷氨酸不低于5000。
222氨基酸標準使用液的制備設(shè)定氨基酸使用液濃度：取1支Waters氨基酸水解液標準，打開后吸取1mL，放至一支干凈的25mL試管中，加85mL超純水，旋渦混勻備用。
223衍生試劑制備將烘箱預(yù)熱至（55±1）℃，取一瓶衍生劑粉2A，輕輕敲動以確保打開前所有粉在瓶底；吸取1mL稀釋液2B并棄去以沖洗一個干凈的微量移液吸頭，移1mL稀釋液2B至2A瓶中，蓋緊瓶蓋，旋渦混勻10min，55℃加熱5~10min使衍生劑粉溶解（加熱不得超過10min）。將溶解后的衍生試劑放入干燥器中，可在室溫保存1星期。
224氨基酸標準品的衍生將烘箱預(yù)熱至（55±1）℃；用微量進樣器吸取10μL標定標準至一支干凈的樣品管底部；移70μL硼酸緩沖液至樣品管中，短暫旋渦混勻；移20μL衍生試劑至樣品管中，立即旋渦混勻數(shù)秒種；室溫放置1min；用封口膜封口，55℃加熱5min既得。
225樣品溶液的制備精密稱取粉碎均勻的樣品50mg，置干燥潔凈的安瓿瓶中，加02％苯酚溶液1mL，加6mol/L鹽酸溶液2mL，充氮，迅速將充好氮氣的安瓿瓶瓶口置于酒精噴燈上封口，置110℃烘箱中水解24h，打開安瓿瓶，取1mL水解液移入蒸發(fā)皿中，蒸干，殘渣用水分次洗滌，合并洗滌液，濾液移至10mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
226樣品溶液的衍生吸取供試品溶液約1mL，通過022μm微孔濾膜過濾，吸取10μL濾液按224以下同法操作。進樣量1μL。
測定完成單位：本研究的氨基酸測定由云南省分析測試研究所（中心）完成。測定方法：用高效液相色譜儀（HPLC）方法測定氨基酸。檢查和判定標準為GB/T5009124-2003。GB/T5009124-2003由中華人民共和國衛(wèi)生部和中國國家標準化管理委員會發(fā)布，是國家標準。
3測定結(jié)果
谷氨酸和精氨酸在以上6種治療胃腸病藥物中的含量均較高，谷氨酸的含量在L-谷氨酰胺呱侖酸鈉>復(fù)方谷氨酰胺>蒙脫石散>馬蹄香>鹽酸小檗堿片>參苓健脾胃顆粒。精氨酸的含量在復(fù)方谷氨酰胺中>馬蹄香>蒙脫石散>鹽酸小檗堿片>參苓健脾胃顆粒。纈氨酸的含量在蒙脫石散>馬蹄香>復(fù)方谷氨酰胺>鹽酸小檗堿片>參苓健脾胃顆粒。在蒙脫石散和復(fù)方谷氨酰胺中丙氨酸的含量高于馬蹄香。在蒙脫石散中天冬氨酸的含量高于馬蹄香。鹽酸小檗堿片中的組氨酸、甲硫氨酸高于馬蹄香。在L-谷氨酰胺呱侖酸鈉中胱氨酸、賴氨酸和甲硫氨酸的含量高于馬蹄香。其余氨基酸在馬蹄香中的含量均高于其他藥物中的，馬蹄香散劑中的氨基酸含量是比較豐富的。
4討論
蜘蛛香（ValerianajatamansiiJones）為敗醬草科屬植物，藥用其根莖及根，別名：馬蹄香（云南、廣西）。馬蹄香已載入中國藥典，在《本草綱目》和《滇南本草》中均有記載，具有理氣和中、散寒除濕、活血消腫的功效，用于治療腹脘脹痛、嘔吐泄瀉、小兒疳積、咳嗽、流感等癥，是云南多民族使用的中草藥，其資源豐富，分布較廣。加強其有效成分的研究，對馬蹄香的開發(fā)和推廣應(yīng)用極為重要，也是發(fā)掘和研究天然藥物及民族民間醫(yī)藥的需要。
本研究測定了單方中藥馬蹄香散劑中氨基酸含量，并與治療胃腸病有效的藥物蒙脫石散、復(fù)方谷氨酰胺、鹽酸小檗堿片、參苓健脾胃顆粒和L-谷氨酰胺呱侖酸鈉中的氨基酸含量進行比較，發(fā)現(xiàn)谷氨酸和精氨酸在以上6種治療胃腸病藥物中的含量均較高，谷氨酸的含量在L-谷氨酰胺呱侖酸鈉>復(fù)方谷氨酰胺>蒙脫石散>馬蹄香>鹽酸小檗堿片>參苓健脾胃顆粒。精氨酸的含量在復(fù)方谷氨酰胺中>馬蹄香>蒙脫石散>鹽酸小檗堿片>參苓健脾胃顆粒。纈氨酸的含量在蒙脫石散>馬蹄香>復(fù)方谷氨酰胺>鹽酸小檗堿片>參苓健脾胃顆粒。在蒙脫石散和復(fù)方谷氨酰胺中丙氨酸的含量高于馬蹄香。在蒙脫石散中天冬氨酸的含量高于馬蹄香。鹽酸小檗堿片中的組氨酸、甲硫氨酸高于馬蹄香。在L-谷氨酰胺呱侖酸鈉中胱氨酸、賴氨酸和甲硫氨酸的含量高于馬蹄香。其余氨基酸在馬蹄香中的含量均高于其他藥物中的，馬蹄香散劑中的氨基酸含量是比較豐富的，有其特點。
氨基酸進入腸道組織后，通過3種途徑代謝：①合成蛋白質(zhì)；②通過轉(zhuǎn)氨基作用生成其他氨基酸、代謝底物或中間產(chǎn)物；③完全氧化成CO2，和H2O。在前兩種代謝途徑中，氨基酸可被機體用于生長或其他生物學功能。一旦完全氧化成CO2，則是對氨基酸的浪費，尤其是必需氨基酸。隨著人們對Gln、谷氨酸和精氨酸認識的逐步深入，臨床上在嚴重創(chuàng)傷、大手術(shù)、燒傷等應(yīng)激狀態(tài)下或長期行TPN時補充Gln、谷氨酸和精氨酸，可降低腸黏膜的通透性，維護腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性，增強黏膜免疫功能，減少腸道細菌移位，可避免腸源性感染的發(fā)生。
在Gln合成酶的作用下，谷氨酸與氨反應(yīng)生成Gln。L-精氨酸在肝或腎內(nèi)合成，合成的前體物質(zhì)是谷氨酸或Gln。腸道黏膜條件必需氨基酸如谷氨酰胺（Gln）、谷氨酸和精氨酸，在調(diào)節(jié)腸形態(tài)和功能完整性起著重要作用。每天食入的谷氨酸、Gln、天冬氨酸和血液Gln進入腸黏膜后，成為小腸能量的主要來源，為小腸養(yǎng)分的主動轉(zhuǎn)運和蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)提供足量的ATP；谷氨酸是合成谷胱甘肽的前體物，谷胱甘肽是保護腸黏膜免受毒素入侵和氧化損傷的關(guān)鍵組分；精氨酸是NO的生理來源之一，NO在調(diào)節(jié)腸道血流量、酶的分泌和上皮細胞生長等起主要作用；精氨酸和Gln的代謝產(chǎn)物鳥氨酸是合成多胺的前體物，多胺是腸道上皮細胞修復(fù)所必需的物質(zhì)[4]。
小腸黏膜中的精氨酸在上皮細胞精氨酸酶Ⅱ的作用下合成NO、多胺、脯氨酸、谷氨酸、尿素和鳥氨酸。精氨酸及其腸內(nèi)衍生物如NO、多胺和鳥氨酸等，對于維持正常的腸道健康生長起著重要的作用[5]。還有研究表明，精氨酸的腸保護作用主要由其產(chǎn)生的NO完成。NO是一種自由基性質(zhì)的脂溶性氣體物質(zhì)，由一氧化氮合酶（NOS）催化精氨酸產(chǎn)生。動物消化道均有NOS分布，各段密度不同，其中以小腸最多[6]。NO可影響腸上皮細胞的緊密連接、促進腸道黏液和電解質(zhì)分泌、調(diào)節(jié)腸黏膜的血流量和維持腸黏膜微循環(huán)[7]。Blachier等的研究表明，精氨酸生成多胺后，可促進腸道上皮細胞的分化增生。因此，必須給予一定量的精氨酸才能滿足腸道快速發(fā)育的需要[8]。最近的研究表明，精氨酸還可激活腸上皮細胞mTOR和一些激酶信號通路，從而提高蛋白質(zhì)合成、增強細胞分化能力和有助于修復(fù)受損的腸道上皮細胞[9]。
腸內(nèi)谷氨酰胺補給支持能快速有效地促進Peyer’s結(jié)淋巴細胞增殖，尤其是B細胞，增加Peyer’s結(jié)內(nèi)淋巴細胞總數(shù)：有利于腸道免疫屏障的恢復(fù)和強化[10]。Peyer’S結(jié)是腸系膜相關(guān)淋巴組織（gut associatedlymphoidtissueGALT）的主要成員之一，其中心區(qū)域是B細胞的富含區(qū)，并具有生發(fā)中心，主要含IgA淋巴母細胞即slgA陽性細胞，是黏膜分泌IgA細胞的主要來源，也是小腸內(nèi)誘導免疫應(yīng)答的最重要部位[11]。在腸道黏膜免疫系統(tǒng)中，Peyer’s結(jié)淋巴細胞直接參與了腸道抗原的識別、呈遞和免疫效應(yīng)，他們的功能和狀態(tài)直接反映了腸道黏膜免疫系統(tǒng)的功能和狀態(tài)：因此可以說Peyer’s結(jié)構(gòu)成了腸道免疫屏障的基礎(chǔ)，維護和優(yōu)化Peyer’s結(jié)內(nèi)細胞結(jié)構(gòu)、功能狀態(tài)對于宿主的防御和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定極為重要[12]。
研究和臨床資料均表明補充Gln、谷氨酸和精氨酸，可降低腸黏膜的通透性，維護腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性，增強黏膜免疫功能，減少腸道細菌移位，馬蹄香用于治療腹瀉病并有其特殊的效果，可能與其所含的谷氨酸、精氨酸對受損胃腸組織的生長、粘膜修復(fù)及免疫功能調(diào)節(jié)的特殊作用有關(guān)系。本研究從馬蹄香散劑中氨基酸含量分析對馬蹄香的治療機制提供了一定的實驗依據(jù)。
參考文獻：
［1］PangQiFang，WanXinBang，ChenShiDe，etalTreatmentofrotavirusinfcctionintreeshrews（TupaiaBelangeriYunalis）withHerbaValerianaJatamansi（VJ）［J］JTradChinMed，1984，4（4）：301~306
?。?］云南省小兒腹瀉防治協(xié)作組馬蹄香治療輪狀病毒腸炎的研究［J］中華兒科雜志，1985，23（8）：129
?。?］黃永坤，李海林，魏群德，等秋瀉靈治療不同RNA型輪狀病毒腸炎94例［J］中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，20（4）：298~299
?。?］李凡，解建平，杜曾慶復(fù)方馬蹄香顆粒治療嬰幼兒輪狀病毒腸炎臨床觀察［J］中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25（8）：762
?。?］張佩紅，陳嘯洪，王燕，等馬蹄香治療嬰幼兒輪狀病毒腸炎作用機制的初步探討［J］中國全科醫(yī)學，2010，13（6）：610~612
?。?］騰初興“秋瀉靈”的毒性及其對腸肌功能的觀察［J］昆明醫(yī)學院學報，1988，7（2）：23~26
?。?］易雪靜，閭四平，李瓊條件必需氨基酸營養(yǎng)代謝與腸道健康［J］腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)，2009，16（1）：58~60
?。?］LukGD，Marion13，BaylinSBOruithinedecarboxylaseisimportantinintestinalmucosalmaturationandrecoveryfrominjuryinrats［J］Science，1980，210（4466）：195~198
?。?］吳國豪腸道屏障功能［J］腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)，2004，11（1）：44~47
?。?0］WardDT，LawsonSA，GallagherCMSustainednitricoxideproductionviaL-arginineadministrationamelioratesefectsofintestinalischemiareperfusion［J］JSurgRes，2000，89（1）：13~19
?。?1］StollB，BurrinDG，HenryJ，etalDietaryandsystemicphenylalanineutilizationformucosalandhepaticconstitutiveproteinsynthesisinpigs［J］AmJPhysiol，1999，276（1）：G49~G57
?。?2］BlachierF，SelamniaM，RobertV，etalMetabolismofL-argininethroughpolyamineandnitricoxidesynthasepathwaysinproliferativeordiferentiatedhumancoloncarcinomacells［J］BiochimBiophysActa，1995，1268（3）：255~262
?。?3］BanH，ShigemitsuK，YamatsjiT，etalArginineandleucineregulatep70S6kinaseand4E-BP1inintestinalepithelialcells［J］IntJMolMed，2004，13（5）：537~543
?。?4］鄧志云，郭光華，邢娟娟，等早期腸內(nèi)谷氨酰胺補給對燙傷大鼠Peyer’s結(jié)淋巴細胞亞群的影響［J］世界華人消化雜志，2009，17（26）：2679~2685
?。?5］CasolaS，Ra{ewskyKBcellrecruitmentandselectioninmouseGALTgerminalcenters［J］CurrTopMicrobiolImmunol，2006，308：155~171
?。?6］張中偉，秦環(huán)龍腸道樹突狀細胞的特性及功能研究［J］世界華人消化雜志，2006，14：2229~2232
?。?7］FagarasanSEvolution，development，mechanismandfunctionofIgAinthegut［J］CurrOpinImmunol，2008，20：170~177
［18］CalderPCImmunonutritioninsurgicalandcriticallyillpatients［J］BrJNutr，2007，98Suppl1：S133~S139
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