二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚胚胎發(fā)育及成活率的影響

陳文利 趙梅 楊麗莉 高麗蕙 王合全 王建佳 高翔 陳昌生

·論著·

二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚胚胎發(fā)育及成活率的影響

陳文利 趙梅 楊麗莉 高麗蕙 王合全 王建佳 高翔 陳昌生

目的應(yīng)用模式生物斑馬魚的胚胎發(fā)育技術(shù)，研究3，3’-二甲基聯(lián)苯胺對魚類胚胎發(fā)育的毒性作用和成活率影響。方法受試化合物用甲醇貯備液和蒸餾水配制成水溶液，甲醇含量低于0.3%。設(shè)空白對照和甲醇溶劑對照各一個，3，3’-二甲基聯(lián)苯胺的毒性試驗(yàn)濃度分為 2.16、4.32、6.48、8.64、10.68 mg/L 5個，分別選用20 ml的磨口瓶避光貯存。斑馬魚受精卵收集后馬上進(jìn)行藥物暴露浸洗試驗(yàn)，每個磨口瓶內(nèi)放入15枚新采集的受精卵。然后分別放在溫度為(28±1)℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2小時(shí)觀察一次，每次隨機(jī)抽取3枚受精卵，進(jìn)行拍照，并顯微觀察不同濃度的二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚受精卵及其胚胎發(fā)育過程的影響。結(jié)果4.32 mg/L以上濃度的藥物處理組的斑馬魚受精卵在胚胎發(fā)育早期或卵期就全部死亡，病死率達(dá)到100%;2.16 mg/L 3，3’-二甲基聯(lián)苯胺可以引起半數(shù)斑馬魚受精卵及其胚胎發(fā)育的死亡，2.16 mg/L低濃度的3，3’-二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚的胚胎發(fā)育有一定的加速作用。結(jié)論高濃度的二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚的受精卵及其胚胎發(fā)育有嚴(yán)重的毒害和致死作用，2.16 mg/L低濃度的3，3’-二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚的胚胎發(fā)育可能有一定的加速作用。

3，3’-二甲基聯(lián)苯胺;斑馬魚;胚胎發(fā)育;成活率

聯(lián)苯胺類化合物屬于芳香胺類化學(xué)物質(zhì)，在樹脂、橡膠、染料等化工產(chǎn)業(yè)合成中有廣泛應(yīng)用。以及印染織物的漂洗等多種途徑進(jìn)入環(huán)境。由于首先在職業(yè)人群中發(fā)現(xiàn)膀胱癌的發(fā)病率較高，故引起了科學(xué)家對聯(lián)苯胺類化學(xué)物質(zhì)的關(guān)注。陳紀(jì)綱通過連續(xù)18年的健康監(jiān)護(hù)，采用病例對照研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯胺的職業(yè)接觸人群中膀胱癌發(fā)病率超過1%，是膀胱癌的高危人群［1］。李健等［2］通過用3，3－二氯聯(lián)苯胺對 A 系小鼠經(jīng)口灌胃，發(fā)現(xiàn)可以導(dǎo)致小鼠惡性腫瘤如肺癌、肝膽癌等發(fā)生率增高，研究表明這類化合物對哺乳動物具有直接或潛在的致癌作用，關(guān)于聯(lián)苯胺類化合物對水生生物的毒性研究也有一些報(bào)道［3］。近年來斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn)以其特有的優(yōu)勢正逐步成為急性毒性試驗(yàn)的替代手段［4，5］，目前有關(guān) 3，3’-二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚胚胎發(fā)育影響還未見研究報(bào)道。本研究通過對斑馬魚胚胎的急性毒性試驗(yàn)，觀察胚胎發(fā)育期間二甲基聯(lián)苯胺暴露所導(dǎo)致魚卵形態(tài)及最終孵化率和成活率的變化，探索其敏感性指標(biāo)，以填補(bǔ)此類化合物對水生生物毒性數(shù)據(jù)研究的短缺，進(jìn)一步完善聯(lián)苯胺類化合物對水生生物的毒性研究資料，并可為環(huán)境衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)，也為致癌研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料 二甲基聯(lián)苯胺(3，3’-二甲基聯(lián)苯胺)由石家莊市職業(yè)病防治院提供。分析純，性能穩(wěn)定，在水溶液內(nèi)基本不發(fā)生水解、氧化、光解等反應(yīng)，符合水生毒理學(xué)試驗(yàn)要求。

1.2 試驗(yàn)用魚及其受精卵的采集 斑馬魚為6個月齡以上，體長4 cm左右的紅色品種親魚。按照雌雄魚數(shù)量約為1∶1的比例放養(yǎng)在25 cm×25 cm×30 cm的玻璃水族箱中，控制溶氧0.6 mg/L以上，水溫(26±1)℃，pH 值 8～8.5，水硬度 28～32°dH，光暗比13 h∶11 h。每天喂2次經(jīng)紫外線消毒處理過的紅線蟲(水絲蚓)。在缸底鋪放一層卵石，以誘發(fā)親魚自然繁殖產(chǎn)卵受精。根據(jù)其間隔性產(chǎn)卵的特點(diǎn)而進(jìn)行不間斷的觀察，以便及時(shí)收集受精卵并轉(zhuǎn)移到預(yù)先配制好的蒸餾水內(nèi)。為盡量避免自來水中所含物質(zhì)干擾試驗(yàn)結(jié)果，受精卵和胚胎發(fā)育試驗(yàn)的用水，均為統(tǒng)一配制、充氧飽和、溫度恒定的蒸餾水。未受精卵在1～2 h內(nèi)會變?yōu)槿榘咨?，用吸管及時(shí)剔出。

1.3 儀器設(shè)備 (1)DMBA300-C數(shù)碼照相顯微鏡;(2)光照培養(yǎng)箱;(3)可控溫加熱器;(4)充氧泵;(5)水族箱等。

1.4 方法 按照OECD的要求設(shè)計(jì)胚胎毒性試驗(yàn)［6］，受試化合物用甲醇貯備液和蒸餾水配制成水溶液，甲醇含量低于0.3%。設(shè)空白對照和甲醇溶劑對照各1個，3，3’-二甲基聯(lián)苯胺的毒性試驗(yàn)濃度分為 2.16、4.32、6.48、8.64、10.68 mg/L 5個，分別選用20 ml的磨口瓶避光貯存。根據(jù)以往的研究，胚胎對芳香族化合物的吸收隨著暴露濃度的增大和時(shí)間延長胚胎體內(nèi)的化合物含量不斷增大直至死亡，而在胚胎發(fā)育早期更容易吸收。一般認(rèn)為，器官早期(原腸胚期前，受精后0～8 h)胚胎對致畸原最為敏感［7］。因此，受精卵收集后馬上進(jìn)行藥物暴露浸洗試驗(yàn)，每個磨口瓶內(nèi)放入15枚新采集的受精卵。然后分別放在溫度為(28±1)℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2小時(shí)觀察1次，觀察、統(tǒng)計(jì)不同藥物濃度處理后在不同發(fā)育時(shí)間內(nèi)受精卵的發(fā)育過程、病死率和成活率等，每次隨機(jī)抽取3枚受精卵，進(jìn)行顯微觀察和拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚受精卵及其胚胎發(fā)育過程的影響 見表1。

表1 不同濃度二甲基聯(lián)苯胺處理下斑馬魚受精卵及其胚胎發(fā)育的狀況

2.2 不同濃度二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚胚胎發(fā)育成活率的影響見表2。

表2 不同濃度二甲基聯(lián)苯胺處理下斑馬魚胚胎發(fā)育的成活率

3 討論

根據(jù)靜態(tài)觀察標(biāo)準(zhǔn)，參照蔡翔等［8］的方法，把斑馬魚的早期胚胎發(fā)育過程分為3個時(shí)期:(1)單細(xì)胞期。受精卵外有較厚的透明膠膜，卵內(nèi)密布卵黃顆粒。受精后10 min動物極出現(xiàn)。(2)囊胚期。卵裂后期，胚盤卵裂球數(shù)漸增，卵裂球間的細(xì)胞界限漸變模糊，胚盤高矗于卵黃上，此即囊胚早期。到囊胚晚期，囊胚表面細(xì)胞向卵黃部分下包，胚盤變成弓狀。(3)原腸胚期。胚盤細(xì)胞下包至卵黃1/2處時(shí)，整個囊胚邊緣處形成略厚的胚環(huán)，其上層細(xì)胞為外胚層，下層細(xì)胞為內(nèi)胚層，胚環(huán)背側(cè)增厚形成胚盾。

表1可見，在2 h內(nèi)，由于暴露處理時(shí)間很短，各處理組的受精卵沒有明顯的變化，受精卵呈透明狀，能看到卵的動物極出現(xiàn)2或4個細(xì)胞的卵裂早期現(xiàn)象。蒸餾水對照組和甲醇溶劑(≤0.3%)對照組的受精卵在每個時(shí)間段內(nèi)基本都能夠正常的發(fā)育，依次經(jīng)歷囊胚期、原腸期、體腔的形成、體節(jié)分化、魚形期，至到孵化為仔魚。說明低于0.3%濃度的甲醇助劑，不會造成斑馬魚胚胎發(fā)育的異常。2.16 mg/L藥物處理組的受精卵也能按照上述發(fā)育歷程發(fā)育并孵化出仔魚，但是整個發(fā)育時(shí)間比對照組提前大約24 h，并且還有一些身體微小、頭大尾小的畸形個體出現(xiàn)。這和以往的研究有相似之處，劉紅玲等［8］提出低濃度的二甲基聯(lián)苯胺能促進(jìn)胚胎發(fā)育，而高濃二甲基聯(lián)苯胺則抑制胚胎發(fā)育。有關(guān)低濃度的二甲基聯(lián)苯胺為何能加速胚胎發(fā)育，導(dǎo)致畸形個體出現(xiàn)有待今后進(jìn)一步的研究。

4.32 mg/L藥物處理組的斑馬魚卵少數(shù)能夠發(fā)育為囊胚，但4 h后多數(shù)出現(xiàn)囊胚的變形，隨后就是卵黃的凝聚與胚胎死亡，8～12 h內(nèi)，胚胎全部死亡。6.48 mg/L以上藥物處理組的受精卵都不能發(fā)育為囊胚期，很早就表現(xiàn)出明顯的卵黃凝聚反應(yīng)而使受精卵快速死亡。這說明4.32 mg/L左右的3，3’-二甲基聯(lián)苯胺可能是斑馬魚受精卵和胚胎發(fā)育的致死的臨界濃度。死亡的受精卵或胚胎都表現(xiàn)出卵黃凝聚，這可能是高濃度的二甲基聯(lián)苯胺類物質(zhì)能夠引起蛋白質(zhì)的變性所導(dǎo)致的。以往的研究認(rèn)為，在受精后0～8 h，原腸胚之前這段時(shí)間內(nèi)，胚胎被暴露在高濃度的有毒化合物中，可能會導(dǎo)致遺傳物質(zhì)改變或蛋白質(zhì)的凝聚反應(yīng)，這種損傷是不可修復(fù)的［9］。

由表2可見，蒸餾水對照和甲醇溶劑對照處理下，斑馬魚受精卵胚胎發(fā)育的成活率分別達(dá)到了96.8%和96.4%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。進(jìn)一步說明了低于0.3%的甲醇溶劑對魚卵發(fā)育沒有明顯影響，可以作為有機(jī)物水環(huán)境染毒實(shí)驗(yàn)的安全助溶劑。

4.32 mg/L以上濃度的藥物處理組的斑馬魚受精卵在胚胎發(fā)育早期或卵期就全部死亡，病死率達(dá)到100%，說明高濃度的3，3’-二甲基聯(lián)苯胺對魚卵及其胚胎毒性作用很強(qiáng)。2.16 mg/L的二甲基聯(lián)苯胺暴露處理后，有約1/2的胚胎死亡或致畸而死，還有約1/2的受精卵(46.8%)能夠發(fā)育并孵化為仔魚，基本說明該濃度可能是影響斑馬魚受精卵及其胚胎發(fā)育的臨界濃度。2.16 mg/L 3，3’-二甲基聯(lián)苯胺可以作為影響水生生物生存的一個限定指標(biāo)。(1)低于0.3%(體積分?jǐn)?shù))濃度的甲醇溶液，對斑馬魚的受精卵和胚胎發(fā)育無明顯影響，可作為有機(jī)物水環(huán)境染毒實(shí)驗(yàn)的安全助溶劑。(2)高濃度的3，3’-二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚的受精卵及其胚胎發(fā)育有嚴(yán)重的毒害和致死作用，4.32 mg/L左右可以使是斑馬魚受精卵及其胚胎發(fā)育全部致死，因此該濃度可能是一個致死臨界濃度。(3)2.16 mg/L 3，3’-二甲基聯(lián)苯胺可以引起半數(shù)斑馬魚受精卵及其胚胎發(fā)育的死亡，可以作為影響和評價(jià)水生生物生存的一個限定性毒理指標(biāo)。(4)除了致死和致畸作用外，2.16 mg/L低濃度的3，3’-二甲基聯(lián)苯胺對斑馬魚的胚胎發(fā)育可能有一定的加速作用，有待今后進(jìn)一步研究。

1 陳紀(jì)剛.上海市聯(lián)苯胺接觸人群職業(yè)性膀胱癌的醫(yī)學(xué)監(jiān)護(hù).中國腫瘤，2001，10:206-209.

2 李健，黃超，竇桂榮.3，3-二氯聯(lián)苯胺經(jīng)口誘發(fā)A系小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的觀察.癌變·畸變·突變，2003，15:81-84.

3 Schulte C，Nagel R.Test acute toxicity in the embryo of zebrafish，Brachydanio rerio，as an alternative to the acute fish test:Preliminary results.ATLA，1994，22:12-19.

4 朱琳，史淑潔.斑馬魚胚胎發(fā)育技術(shù)在毒性評價(jià)中的應(yīng)用.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，13:252-254.

5 端正花，張斌田，朱琳.雙酚A對斑馬魚胚胎發(fā)育各階段的毒性及生物蓄積.中國環(huán)境科學(xué)，2008，28:260-263.

6 OECD.Guideline for testing of chemicals:Fish，embryo toxicity test with the zebrafish(Brerio).OECD，1996，62-76.

7 劉紅玲，于紅霞.聯(lián)苯胺類化合物對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的初步研究.生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2007，2:94-99.

8 蔡翔，王捷，王穎.應(yīng)用胚胎檢測技術(shù)評價(jià)氟嗎啉對斑馬魚胚胎—幼體發(fā)育的影響.農(nóng)藥，2005，44:271-273.

R 321-33

A

1002－7386(2011)17－2610－03

10.3969/j.issn.1002 －7386.2011.17.021

項(xiàng)目來源:河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號:072761891)

050031 河北省石家莊市職業(yè)病防治院(陳文利、楊麗莉、高麗蕙);河北省自然科學(xué)基金委員會(趙梅);河北省水產(chǎn)技術(shù)推廣站(王合全);河北師范大學(xué)(王建佳、高翔、陳昌生)

1.5 標(biāo)準(zhǔn)及指標(biāo) 試驗(yàn)過程中，受精卵的死亡按照發(fā)育過程中卵黃出現(xiàn)凝集為準(zhǔn);胚胎死亡按照沒有身體運(yùn)動、沒有心動、身體變渾不透明為準(zhǔn)。成活率以仔魚從胚胎孵化出來之后的成活個體計(jì)算。成活率為每百粒卵能發(fā)育到48 h并孵化為仔魚的卵數(shù)。

2011－03－15)